牛源腔隙莫拉菌的分離鑒定與藥敏試驗

朱利霞，王洪彬，趙希艷，王雙月，史秋梅，高光平

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 秦皇島 066600)

莫拉菌屬的細菌是短鏈狀或成對狀的革蘭陰性菌、短且寬，接近球狀，一直被認為具有潛在的致病性，多數寄居在人和溫和動物的皮膚和黏膜中，如上呼吸道、口腔，是呼吸道繼發性感染致病菌之一[1]。文獻顯示，從豚鼠[2]、駱駝[3]、山羊[4-5]、犬[6]等多種動物中分離到該菌。近年來，由該菌屬細菌引起的細菌性疾病呈逐年增加趨勢，部分分離株致病性較強，其中腔隙莫拉菌主要引起結膜炎、腦膜炎、肺炎、慢性鼻竇炎和心內膜炎等病癥[7]；該菌引起人類患病的報道也在逐年增多[8-9]，但未見從病牛分離到腔隙莫拉菌的報道。本研究以河北省某牛場采集的病牛鼻腔拭子樣品中分離純化得到的病原菌為試驗菌株，對其進行細菌鑒定和藥敏試驗，為由腔隙莫拉菌引起的牛細菌性疾病的防控提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源 患呼吸道病牛的鼻拭子，采集自河北省某養牛場；昆明系小鼠，體質量 20±2g，雌雄各一半，購自北京維通利華實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購自北京奧博星生物技術有限責任公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；E.Z.N.A.TMPlasmid MiniKit 質 粒提取試劑盒、Gel extraction kit 購自 Omega 公司；DL 2000 DNA Marker、dNTP、ExTaqDNA聚合酶購自TaKaRa 公司；常規藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；pMD18-T 載體、大腸桿菌感受態細胞DH5α 購自北京全式金生物技術有限公司；本研究用到的中藥購自秦皇島民樂醫藥。

1.3 病原菌的分離純化 將無菌采集的病牛鼻拭子樣品接種于TSA平板(含 5 %胎牛血清)，置 37 ℃培養24 h；挑取優勢菌株的單菌落再次劃線接種于TSA、SS、EMB、TCBS培養基上培養 24 h；挑取單菌落經革蘭氏染色鏡檢觀察結果；無菌挑取優勢菌株的單菌落，接種于新鮮的TSB 培養液(含5 %胎牛血清)中，于 37 ℃恒溫搖床中培養 24 h，加入甘油凍存菌種。

1.4 病原菌的生化鑒定 挑取優勢菌株單菌落制備菌懸液；利用ID32E 生化鑒定試紙條進行細菌鑒定，由法國梅里埃公司提供的ATB 全自動微生物鑒定系統判定結果。

1.5 分離菌株的16S rDNA 鑒定 利用細菌基因組提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA；利用16S rDNA 通用引物對分離菌株進行PCR 擴增；陽性產物回收與 pMD18-T 載體連接，轉化至E.coli中，PCR 檢測陽性的菌液由北京生工生物工程有限公司測序鑒定。

將測序所得的16S rDNA 基因序列與GenBank中登錄的相應莫拉菌屬細菌進行比對分析，并利用DNAStar 軟件分析其同源性并繪制系統進化樹。

1.6 分離菌株的致病性試驗 將分離菌株單菌落接種于TSB 培養液(含 5 %胎牛血清)中，置37 ℃培養24 h，采用瓊脂平板計數法計算活菌含量；以無菌的 PBS 分別將其 10 倍倍比稀釋(1.0×105cfu/mL～1.0×109cfu/mL)，每個濃度經腹腔注射接種 5 只小鼠，0.2 mL/ 只，對照組 5 只小鼠注射無菌 PBS，0.2 mL/ 只[10]。

1.7 分離菌株的藥敏試驗

1.7.1 西藥藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗執行標準，采用K-B 紙片擴散法進行藥敏試驗并判定結果[11]。

1.7.2 中藥藥敏試驗 按照文獻[12]的水煎煮法提取中藥有效成分，終濃度為1 g/mL；采用瓊脂平板打孔法進行中藥藥敏試驗，試驗菌液濃度為1.0×107cfu/mL。在 TSA 平板(含 5%胎牛血清)均勻涂抹 100 μL分離菌菌液，然后用直徑6 mm 的打孔器打4 個孔，用無菌的0.5 %瓊脂封底，其中第 3 孔加入 100 μL中藥提取液，另1 孔加入無菌等量生理鹽水作陰性對照，重復 3 次，將其正面朝上置 37 ℃培養 24 h后觀察結果，測定抑菌圈直徑。以3 次抑菌圈直徑的平均值作為藥物對該菌的抑菌圈直徑。判定標準:抑菌圈直徑≥20 mm 為極敏，15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm 為高敏，10 mm≤抑菌圈直徑 ＜15 mm 為中敏，抑菌圈直徑＜10 mm 為耐藥。采用試管二倍稀釋法[13]進行中藥最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定。試驗過程中，加入 TTC 有助于準確判斷MIC 值，當孔內不顯示紅色時，即為該中藥的MIC。分別蘸取各試管中的液體，涂布于TSA 平板(含5 %胎牛血清)，觀察有無細菌生長，無細菌生長時的最低濃度即為該中藥的最低殺菌濃度(MBC)[14]。

2 結 果

2.1 分離菌株的形態特征 對患病牛的鼻拭子樣品進行細菌分離，結果分離純化得到1 株優勢菌株；分離菌株不能在 SS、EMB、TCBS 培養基上生長；在TSA 平板上長出乳白色、邊緣整齊、凸起、不透明、濕潤的菌落；在血平板上長出灰白色、濕潤、半透明、圓形、凸起、不溶血菌落；革蘭氏染色結果顯示，分離菌株為革蘭陰性短桿菌或球桿菌，菌體兩端鈍圓，無芽胞，單個或成對排列(圖1)，將其命名為Mor QHD-1。

圖1 分離菌株革蘭氏染色形態(100×)Fig.1 Micrograph of the isolate with Gram staining (100×)

2.2 分離菌株的生化鑒定 對分離菌株Mor QHD-1 進行生化鑒定。結果顯示，Mor QHD-1 具有觸酶、氧化酶活性，無苯丙氨酸脫氫酶活性；硝酸鹽還原反應和明膠液化反應均為陽性；不能發酵麥芽糖、甘露醇、木糖、蔗糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖；不能分解尿素及不能利用枸櫞酸鹽；V-P 試驗陰性；不產生硫化氫等。參考 《 伯杰細菌鑒定手冊》進行比對，分離菌株Mor QHD-1 符合腔隙莫拉菌(Moraxella lacarnata)的生理生化特性。

2.3 分離菌株的16S rDNA 鑒定 以分離菌株Mor QHD-1的基因組DNA為模板，進行16S rDNA 的PCR擴增。結果顯示，擴增出的片段在 1 500 bp 左右，與預期相符(圖2)，進一步表明分離菌株為腔隙莫拉菌。

圖2 分離菌株Mor QHD-1 的16S rDNA 基因的PCR 擴增Fig.2 Amplification for 16S rDNA gene of Mor QHD-1 isolate by PCR

2.4 分離菌株的同源性分析及系統發育樹的建立將測序得到的16S rDNA 基因序列經Blast 比對分析，結果顯示分離菌株 Mor QHD-1 的 16S rDNA 基因序列與GenBank 中腔隙莫拉菌相應基因序列同源性為97.6 %。系統發育樹顯示分離菌株Mor QHD-1與液化莫拉菌(Moraxella nonliquefaciens)、犬莫拉菌(Moraxella canis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、林肯莫拉菌(Moraxella lincolnii)、苯丙酮酸莫拉菌(Moraxella phenylpyruvica)、亞特蘭大莫拉菌(Moraxella atlantae)、奧斯陸莫拉菌(Moraxella osloensis)等親緣關系較遠，而與腔隙莫拉菌自然聚為一簇(圖3)，進一步表明了分離菌株 Mor QHD-1 為腔隙莫拉菌。

2.5 分離菌株致病性試驗 將分離菌株Mor QHD-1 采用不同的劑量對小鼠進行致病性試驗，結果顯示，小鼠在感染約12 h 開始出現精神不振，部分小鼠食欲降低，甚至廢絕；小鼠在感染24 h 后，高劑量組小鼠出現不同程度的死亡，而低劑量組小鼠未出現死亡。將死亡的小鼠剖檢，發現小鼠心包有少量積液，肺臟、肝臟有出血點等。無菌取死亡小鼠心包積液、肺臟、肝臟樣品接種于TSA 平板進行細菌分離純化。經形態學觀察、生化鑒定、16S rDNA 鑒定，確定為腔隙莫拉菌，與本實驗接種菌株一致。表明分離菌株Mor QHD-1 具有一定的致病性。

圖3 分離菌株與相關菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences between Mor QHD-1 isolate and the related strains

2.6 分離菌株的藥敏試驗結果

2.6.1 西藥藥敏試驗結果 藥敏試驗結果如表1 所示，因此可以選用氨基糖苷類、氟喹諾酮類和β- 內酰胺酶類藥物治療由腔隙莫拉菌引起的牛細菌性疾病。

表1 分離菌株西藥敏感性試驗結果Table 1 Drug susceptibility test of the isolate

2.6.2 中藥藥敏試驗結果 選用動物養殖中常用中藥進行敏感性試驗。結果顯示，分離菌株 Mor QHD-1 對蘇木、訶子、烏梅、黃柏、五味子、黃連、五倍子極敏；對知母、厚樸等中藥耐藥(表2)。蘇木、黃柏、五倍子、黃連對腔隙莫拉菌的MIC 和MBC 較小，均在 1.95 mg/mL～7.82 mg/mL，其次為訶子、烏梅、五味子的 MIC 和 MBC 在 15.63 mg/mL～62.50 mg/mL。表明分離菌株 Mor QHD-1 對不同中藥敏感性不同。

表2 分離菌株中藥藥敏試驗結果Table 2 Chinese herbal medicine susceptibility test of the isolate

3 討 論

腔隙莫拉菌是一種條件性致病菌，也是人畜共患菌之一，其可以導致結膜炎、兒童中耳炎、慢性鼻竇炎及咽炎。由該菌引起的侵入性感染比較少見，國外曾有報道該菌引起人敗血癥[1,15]、化膿性關節炎[16]和感染性心內膜炎[17]等，國內由該菌引起的病例也較為少見。謝林峰等在患病嬰兒血液中分離到腔隙莫拉菌[18]；沈伊娜等報道腔隙莫拉菌可以引起人類敗血癥[19]；趙莉萍等從腦脊液中分離到1 株腔隙莫拉菌[20]；白麗等報道該菌致一位腎衰女性患者尿路感染[21]；楊海蓮等首次在茶飲料中檢測出腔隙莫拉菌并導致人發病[22]；梁莎莎報道腔隙莫拉菌可以引起男泌尿、生殖道感染[9]，因此具有公共衛生學意義。近年來由腔隙莫拉菌引起人類發病的病例報道逐年增多[9,23]，已經引起醫護人員和科研工作者的重視。本實驗從患有呼吸道疾病的牛鼻腔拭子中分離到1 株優勢菌株，通過常規形態學觀察、生理生化鑒定和分子生物學的方法鑒定，結果顯示分離菌株Mor QHD-1 與腔隙莫拉菌同源性高達97.6%，與腔隙莫拉菌屬于同一進化分支。致病性試驗結果顯示，該分離菌株對小鼠具有一定的致病性，因此在獸醫臨床上不可忽視該菌對養殖業的潛在威脅。

有效、合理使用藥物是防治細菌性疾病的重要措施之一。西藥藥敏試驗結果表明，分離菌株Mor QHD-1 對受試的15 種常用的抗菌藥物大部分均敏感，這可能也是該菌引起的相關疾病偶有發生，未出現大面積流行的重要原因。此外，中藥藥敏試驗結果顯示，分離菌株 Mor QHD-1 對蘇木、訶子、烏梅、黃柏、五味子、黃連、五倍子極敏；對其余中藥的敏感性不同。因此，治療由該菌引起的疾病，需結合動物本身的實際情況，根據藥敏試驗結果合理用藥。

本實驗分離的牛源腔隙莫拉菌為國內首次分離，且具有一定的致病性；此外，董文龍等研究證實腔隙莫拉菌能夠跨物種傳播，使山羊和人類感染發病[5]，這給畜牧業的安全生產及人類的健康帶來一定的風險。目前，國內外有關該菌的研究相對較少，因此對其流行趨勢還需要更進一步的研究。