豬傳染性胃腸炎病毒誘導PK-15細胞凋亡相關基因mRNA轉錄水平變化的研究

龔雙燕，李小璟，李幽幽，朱 玲,2，徐志文,2*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主性死亡方式，是一種主動的、程序性的、細胞固有的生物學過程，又稱細胞程序性死亡[1]。細胞凋亡的發生是受到一系列基因表達調控的，在對多種細胞凋亡通路研究發現，盡管細胞種類及誘導凋亡發生的原因各有不同，但凋亡的發生均與凋亡基因的表達密切相關；且多種病毒在其感染細胞的過程中可以引起細胞周期紊亂，進一步導致細胞凋亡[2-6]。細胞凋亡發生以及調控是細胞凋亡基因之間相互作用的結果，其中Bcl-2，B 細胞淋巴瘤 2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族是多種細胞凋亡程序的主要調控者[7]。

2012年，丁利等人發現，豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)感染PK-15 細胞會誘導細胞發生凋亡[8]，本研究對感染TGEV SC-T 株前后PK-15 細胞中Bcl-2家族分子(Bcl-XL抗凋亡基因、MCL-1抗凋亡基因及PUMA促凋亡基因)的 mRNA 轉錄水平進行測定，探究TGEV SC-T 對PK-15 細胞凋亡相關基因轉錄的影響及規律，為細胞凋亡與病毒增殖相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 PK-15 細胞系、TGEV SC-T 株均由四川農業大學生物技術中心保存。pMD19-T Simple Vector 、RNA 抽提試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green Premix ExTaqⅡ、DL2000 DNA Marker 等均購自天根生化科技(北京)有限公司；eBioscienceTMAnnexin V-FITC Apop Kit 100 tests購自Invitrogen。含BechinⅠ ，AIG5，AIG12重組質粒和大腸桿菌DH5α 感受態細胞由本實驗室自制。

1.2 引物設計與合成 根據GenBank 中登錄的豬源Bcl-xL(AF216205.1 等)、MCL-1(NM_001348806.1等)及PUMA(XM_003127254.5 等)基因序列 ，利用DNAStar 軟件分析比較，選擇保守區域序列，利用Primer Primer5 分別設計特異性引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 重組質粒標準品的制備 TGEV 感染PK-15 細胞48 h 后收獲病毒，利用RNA 抽提試劑盒其提取總RNA，采用反轉錄試劑盒獲得cDNA，以其為模板，利用Bcl-XL、MCL-1和PUMA的引物分別進行PCR 擴增。反應條件為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、59 ℃30 s、72 ℃ 20 s，35 個循環；72 ℃ 7 min。取 5 μL PCR 產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收目的片段，克隆至pMD19-T simple Vector，構建重組標準質粒pBcl-XL、pMCL-1和pPUMA，測定并計算其拷貝數。

表1 熒光淀量PCR(qPCR)的引物Table 1 Primers for the qPCR assays

1.4 qPCR 方法的建立

1.4.1 反應條件的優化 反應體系采用 10 μL，利用方陣試驗分別對引物、退火溫度和反應程序進行優化，以熒光值、Ct 值、溶解曲線為判定依據，同時設立空白對照，選擇最優的反應條件。

1.4.2 標準曲線的繪制 以10 倍倍比稀釋重組質粒pBcl-XL、pMCL-1和pPUMA，取 7 個倍比稀釋的重組質粒(102拷貝 /μL～108拷貝 /μL)作為模板，同時設立空白對照，做3 個平行重復。參照優化后的的反應條件進行qPCR 擴增，每個反應平行重復3 次。以拷貝數為橫坐標，Ct 值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.3 qPCR 方法特異性、敏感性試驗 采用所建立的qPCR方法對pBcl-XL、pMCL-1和pPUMA重組質粒交叉檢測，同時對含自噬相關基因Beclin1、ATG5 和ATG12 的重組質粒進行檢測，評價該方法的特異性；將標準質粒做10 倍倍比稀釋至10-9后作為模板，進行常規PCR 和qPCR 擴增，對比分析兩種方法，判定本試驗建立的qPCR 敏感性。

1.5 TGEV 感染PK-15 細胞凋亡率的檢測 將對數生長期的PK-15 細胞接種于6 孔細胞培養板中，約長成80%的豐度時接種TGEV 于不同感染時間(2 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)收集細胞。取100μL濃度為106個/mL的單細胞懸液，250 r/min離心5 min，棄上清，按照Annexin V-FITC Apop kit 方法，加入新鮮配置的1×結合緩沖液 200 μL 重懸細胞，加入 5 μL 的 Annexin V-FITC染色熒光染料染色10 min，室溫避光；加入PI 染色5 min，室溫避光。加 400 μL PBS，重懸細胞，利用流式細胞術檢測凋亡細胞，采用CytExpert 軟件對數據結果進行分析。

1.6 凋亡相關基因mRNA 轉錄水平的檢測 用胰酶消化PK-15 細胞后制成細胞懸液，加入6 個12 孔板中，每孔 2 mL。待細胞鋪滿單層后，3 個 12 孔板接種 TGEV (實驗組)，3 個加入 PBS (對照組)。實驗重復3 次。分別于接種病毒后不同時間點(0、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)收集細胞上清液以及細胞，使用TRIzol法提取不同時間感染PK-15 細胞上清液以及細胞總RNA，反轉錄為 cDNA，利用 1.4 建立的 qPCR 方法分別檢測Bcl-XL、MCL-1和PUMA的 mRNA 轉錄水平。

2 結 果

2.1 qP CR 方法的建立

2.1.1 反應條件的優化 經方陣優化后的結果為：反應體系 10 μL，其中上下游引物分別為 0.5 μL，質粒標準品 1 μL，SYBR Green Premix ExTaqⅡ5 μL，ddH2O 補足到 3 μL；退火溫度均為 59 ℃；反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共39 個循環。

2.1.2 凋亡相關基因標準曲線的建立 以10 倍倍比稀釋的重組質粒為模板進行qPCR，擴增結束后系統自動繪制出標準曲線。如圖1顯示，質粒標準品拷貝數與其對應的Ct 值線性關系良好，檢測Bcl-XL、MCL-1和PUMA的 qPCR 方法標準曲線分別為：y=-3.442x+37.994，y=-3.481x+39.177，y=-3.240x+37.468；相關系數 R2分別為：1、0.996、1，所建立的qPCR 對陽性標準品的擴增產物經融解曲線分析顯示，分別在融解溫度(Tm)為85.0 ℃左右出現了唯一的特異性峰，無引物二聚體、雜峰出現(圖略)。

2.1.3 特異性、敏感性試驗結果 利用建立的qPCR方法對凋亡基因Bcl-XL、MCL-1和PUMA交叉檢測及含自噬相關基因Beclin1、ATG5和ATG12的重組質粒進行檢測，結果顯示，除了pBcl-XL、pMCL-1和pPUMA陽性外，其余檢測結果均為陰性；將標準質粒做10 倍倍比稀釋至10-9后作為模板，進行常規PCR 和 qPCR 擴增，qPCR 可以檢測到熒光信號而普通 PCR 并無電泳條帶(圖2)，表明 qPCR方法的敏感性高于普通PCR 方法。上述結果表明qPCR 方法具有良好的特異性、敏感性，可以用于后續實驗。

圖1 凋亡相關基因Bcl-xL(A), MCL-1(B), PUMA(C) qPCR 的標準曲線Fig.1 The standard curve of the qPCR of autophagy - related gene Bcl-xL(A), MCL-1(B), PVMA(C)

2.2 TGEV 感染PK-15 細胞凋亡率的檢測 通過流式細胞儀檢測不同時間段TGEV 感染的PK-15 細胞凋亡率。結果顯示，對照組PK-15 細胞凋亡率為2.80 %, 實驗組感染 TGEV 后 24 h～36 h 期間凋亡率從16.29 %上升至30.53 %，與對照組相比差異顯著p＜0.05 (圖3)。表明 TGEV 能夠顯著誘導 PK-15細胞發生凋亡。

2.3 凋亡相關基因mRNA 轉錄水平的檢測結果利用所建立qPCR 方法檢測實驗組與對照組感染TGEV 后各時間點凋亡相關基因轉錄水平。結果顯示，抗凋亡基因Bcl-xLmRNA 轉錄水平在感染后0～36 h 對照組低于實驗組，差異極顯著(p＜0.01)，36 h 后實驗組mRNA 轉錄水平快速下降，對照組無明顯變化，對照組mRNA 轉錄水平反而高于試驗組，差異極顯著(p＜0.01)；抗凋亡基因MCL-1mRNA 轉錄水平在感染 TGEV 后(試驗組) 2 h～72 h 快速下降，而對照組mRNA 轉錄水平下降速度相對緩慢，在同一時間點二者相比差異均極顯著(p＜0.01)；而促凋亡基因PUMA的mRNA 轉錄水平在感染后36 h，對照組高于試驗組，尤其在感染后 0～8 h，二者之間差異極顯著(p＜0.01)，感染 36 h 后試驗組mRNA 轉錄水平快速上升，對照組無明顯變化，試驗組mRNA 轉錄水平反而高于對照組，感染后48 h～60 h 二者差異顯著(p＜0.05)，感染后 72 h 二者差異極顯著(p＜0.01)，72 h 時達到最高 mRNA 轉錄水平，與抗凋亡基因Bcl-xLmRNA 轉錄規律相反(圖4)。表明TGEV 的增殖在36 h 處于最高峰時為凋亡基因轉錄的一個轉折點。

圖2 凋亡相關基因Bcl-xL 、MCL-1、PUMA qPCR 特異性(A)、敏感性(B)試驗Fig.2 The specificity and sensitivity test of the qPCR for detections of the Bcl-XL, MCL-1 and PUMA genes

圖3 TGEV 感染PK-15 細胞凋亡率的檢測Fig.3 Apoptotic rate in TGEV infected PK-15 cells

圖4 感染TGEV 后不同時間Bcl-XL、MCL-1 和PUMA mRNA轉錄水平的檢測結果(*：p＜0.05；**：p＜0.01)Fig.4 Linear curve of transcribed mRNA copy number of Bcl-XL,MCL-1 and PUMA (*: p＜0.05；**: p＜0.01)

3 討 論

病毒感染細胞后引起細胞凋亡，尤其是在病毒的對數生長期之后，但其具體調控模式尚不清楚，為了解細胞凋亡發生及其調控模式，凋亡相關基因的研究十分有必要。細胞凋亡主要有兩條通路，一是線粒體通路，二是死亡受體通路。線粒體處于細胞凋亡轉導的核心地位，而Bcl-2 家族成員對線粒體外膜通透性有關鍵的調控作用[9]。丁利等研究顯示 TGEV 感染細胞后，能夠通過調節 Bax 和 Bcl-2的表達量，直接激活線粒體通路[10]，也有研究表明，過表達Bcl-xL基因能夠使CHO 細胞獲得抗凋亡能力，提高重組抗體表達量，與 Bcl-2 蛋白相比，Bcl-xL 蛋白保護細胞免于凋亡的能力更強[11-12]。目前暫無MCL-1、PUMA基因在 TGEV 誘導 PK-15 細胞凋亡中的研究，但二者確是細胞凋亡中的重要凋亡因子[13-14]。所以本研究主要圍繞 Bcl-2 家族成員Bcl-xL、MCL-1及PUMA基因展開研究。

本研究實驗結果顯示，建立的qPCR 方法與質?？截悢礐t 值線性關系良好，融解曲線無引物二聚體、雜峰出現；敏感性高于普通PCR 方法；對非目的基因檢測結果顯示除目的基因為陽性外，其余檢測結果均為陰性。表明建立了3 種敏感性、特異性均較高的qPCR 檢測方法。采用該方法對凋亡相關基 因Bcl-xL、MCL-1及PUMA的mRNA轉錄水平進行檢測，結果顯示，TGEV 感染 PK-15 細胞后，隨著 TGEV 感染細胞時間的延長，抗凋亡基因Bcl-xL、MCL-1mRNA 轉錄水平呈下降趨勢，抗凋亡基因PUMA的 mRNA 轉錄水平呈上升趨勢，TGEV 誘導PK-15 細胞發生凋亡的比率隨著病毒感染時間的延長而上升。與丁利等得出TGEV 能夠下調抗凋亡基因Bcl-2的表達，上調促凋亡基因Bax表達的結論相一致[10]。本研究結果顯示，抗凋亡基因Bcl-xL、促凋亡基因PUMAmRNA 轉錄規律相反，但二者均在GEV 感染 36 h 前后mRNA 轉錄水平出現顯著差異，與TGEV 感染PK-15 細胞凋亡率變化趨勢相一致。本研究發現了凋亡基因Bcl-xL、MCL-1及PUMAmRNA 的轉錄規律與 TGEV 增殖相關聯，但病毒增殖與細胞凋亡之間是怎樣發生作用的目前尚未完全研究清楚，本研究為進一步了解TGEV 誘導PK-15 細胞凋亡的機制提供了實驗依據。