花青素與大豆分離蛋白的不同共價交聯法對蛋白結構的影響

劉英杰，隋曉楠，黃 國，趙思明，徐 悅，劉貴辰，孫紅波，齊寶坤，江連洲*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種全價植物蛋白，富含人體必需氨基酸。其營養豐富，不含膽固醇，是植物蛋白中為數不多的可替代動物蛋白的品種之一，目前被人類廣泛應用于不同食品加工領域中[1-2]。據報道，SPI可以與其他某些食物成分發生相互作用，多酚就是其中一種[3]。多酚是一類廣泛存在于植物體內且具有多元酚結構的次生代謝物，根據其碳骨架的特征，可分為酚酸類、黃酮類、少見的芪類和木脂素類。而花青素就屬于一種常見的水溶性黃酮類化合物，普遍存在于水果和蔬菜中[4-5]。其具有抗氧化、抗炎等生物學活性；并對肥胖癥、糖尿病、胸膜炎等疾病患者的治療起重要作用[6-7]。目前科學研究表明，花青素作為一種小分子物質，其結構具有獨特的理化性質，在食品加工及生產過程中，能與多種化合物發生交互作用，其中蛋白質是最主要的化合物[8]。

研究表明蛋白質與多酚相互作用主要通過兩種方式：可逆的非共價作用和不可逆的共價交聯[5]。其中蛋白與多酚的非共價作用通過形成氫鍵、范德華力、π鍵、疏水作用和離子相互作用實現[9-11]。而共價交聯則主要分為生物共價交聯法和化學共價交聯法，其原理為酚類物質在有多酚氧化酶或堿性（pH 9）條件下，可以被酶或氧氣分子氧化從而形成醌類物質，其醌類物質可以與蛋白質多肽鏈上的氨基酸和巰基形成C—N鍵和C—S鍵，從而完成兩者的共價交聯[12-13]。

本課題組研究發現，SPI與花青素可以形成非共價鍵及共價鍵，并就兩者在堿性條件下發生的共價交聯作用對蛋白結構及界面蛋白性質的影響進行剖析[14-15]。Chung等[16]研究發現在多酚氧化酶（漆酶）存在條件下，兒茶素可以被氧化形成醌類物質，從而與明膠發生共價交聯。Ali等[12]分別利用化學堿法和生物酶法對β-乳球蛋白與綠原酸進行共價交聯處理，結果表明兩種共價交聯方式都使β-乳球蛋白的結構發生改變，且化學堿法對β-乳球蛋白產生的影響大于生物酶法。但是目前在探究蛋白質與多酚相互作用的文獻中，兩者之間共價交聯的研究相對較少[13]且多數局限于單一共價交聯方法，關于生物共價交聯法和化學共價交聯法在同一食品基質中對蛋白結構產生的影響差異解析不夠明確，尤其是花青素與SPI。

由此，為更加明確地了解SPI與花青素共價交聯對蛋白結構的影響，本實驗選用兩種常見的共價交聯機制——生物酶法和化學堿法對不同質量濃度花青素與SPI進行共價處理，并就兩種共價交聯方式對SPI結構產生的影響進行比較，同時探究添加不同質量濃度花青素后對SPI結構的改變。旨在為SPI與花青素共價交聯作用的研究提供重要指導意義，這些研究的積極成果將使人們更加直觀及深入地了解生物酶法與化學堿法對蛋白結構產生的影響，為SPI在食品中的合理應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；SPI由實驗室自制；花青素黑米提取物陜西天之潤生物科技有限公司；乙腈、甲酸（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；漆酶 河北仟盛生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 北京新光化工試劑廠；正己烷、乙酸乙酯、甲醇 天津北科化學品有限責任公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GL-25MS超速高速冷凍離心機 上海盛析儀器設備有限公司；WAT023635高效液相色譜儀、SunFire C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm）美國Waters公司；傅里葉紅外光譜儀 美國尼高麗公司；Tecan Infinite 200 Pro酶標儀 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Petruccelli等[17]的制備方法。大豆去皮粉碎后過60 目篩網，用豆粉-正己烷（1∶3（g/mL））對篩選后的豆粉進行3 次脫脂。得到的脫脂豆粉與去離子水（1∶20（g/mL））混合后，用NaOH溶液（2 mol/L）將混合溶液的pH值調節至8，在室溫攪拌2 h，將其懸浮液在4 ℃、10 000×g離心20 min，取其上清液用鹽酸溶液（2 mol/L）調節pH值至4.5后靜置1 h，在4 ℃、6 000×g離心20 min，得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物用去離子水水洗3次后溶解，用NaOH溶液（2 mol/L）調節蛋白溶液pH 7，將此蛋白溶液凍干并研磨，即可得到SPI。

1.3.2 花青素的提純與定量分析

參考Rodriguez-Saona等[18]的方法對黑米提取物進行提純，用去離子水溶解黑米提取物后，將其抽濾。將濾液通過固相萃取柱以吸附花青素，后用2 倍柱體積的酸化水洗脫樣品中不溶性成分，用2 倍柱體積的乙酸乙酯溶液洗脫樣品中除花青素外的多酚類雜質，最后用酸化的甲醇溶液洗脫吸附于柱上的花青素。將此溶液旋轉蒸發以去除甲醇，即可得到花青素提純物。采用高效液相色譜法對純化后的花青素進行定量分析[19]，取花青素提純物過0.45 μm濾膜后用C18色譜柱聯合高效液相色譜設備進行分析，流量1 mL/min，溫度25 ℃，進樣體積50 μL，檢測器波長520 nm，梯度洗脫條件根據Sui Xiaonan[19]的方法，同時為方便計算，本實驗統一使用矢車菊素-3-葡萄糖苷（黑米提取物中花青素主要成分）質量濃度為花青素質量濃度做近似處理。

1.3.3 SPI與花青素共價聚合物的制備

參考Prigent等[20]的方法并稍作修改。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）配制質量濃度為10 g/L的SPI溶液，分別加入不同質量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，加入漆酶溶液（10 U）避光攪拌24 h。參照Rohn等[21]的方法，用0.01 mol/L PBS配制質量濃度為10 g/L的SPI溶液，分別加入不同質量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，調節溶液pH 9.0后避光攪拌24 h。將6 組反應后的樣品透析48 h（截留分子質量8～10 kDa），每隔8 h換水一次以確保未反應的游離多酚完全透析出去。將透析液凍干，即可得到共價交聯聚合樣品。

1.3.4 共價結合率的測定

花青素與SPI的共價結合率及共價交聯花青素含量的測定參考本課題組之前的研究[15]方法并稍作修改，將所有未經透析的SPI-花青素共價聚合物樣品放入分子截留量為8～10 kDa的透析袋中，并將透析袋放入蒸餾水中在4 ℃透析24 h，后取其透析液用高效液相色譜測定透析液中游離花青素的含量，測定方法與上述花青素定量方法一致?；ㄇ嗨嘏cSPI的共價結合率及共價交聯花青素含量（以SPI計）的計算公式如下：

1.3.5 游離巰基含量的測定

參考Beveridge等[22]的方法并稍作修改。將75 mg樣品溶解于10 mL含有1 mmol/L EDTA和1% SDS的PBS中（0.1 mol/L，pH 8.0），取3 mL樣品溶液加入3 mL上述PBS，再加入0.1 mL Ellman's試劑，混勻后于25 ℃條件下水浴1 h，將其混合物在10 000×g離心30 min，取上清液在412 nm波長處測定吸光度。其中以不加Ellman's試劑的混合液為空白。用公式（3）計算巰基的含量：

式中：A412nm為在412 nm波長處的吸光度；C為樣品質量濃度/（mg/mL）；D為稀釋倍數；73.53=106/（1.36×104），其中 1.36×104為摩爾吸光系數。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

參考劉勤勤等[23]的方法，將樣品粉末與溴化鉀粉末按1∶100的比例混合后壓片，在分辨率為4 cm-1條件下掃描64 次，600～4 000 cm-1波數譜段范圍內記錄紅外光譜。

1.3.7 紫外-可見光譜分析

參考劉勤勤等[23]的方法稍作修改。用PBS（0.01 mol/L，pH 7）溶解樣品使蛋白質量濃度為0.5 mg/mL，取200 μL樣品溶液置于96 孔板中，用紫外-可見分光光度計掃描260～350 nm波長范圍內的吸收光譜。

1.3.8 熒光光譜分析

根據Roy等[10]的方法稍加修改。用PBS（0.01 mol/L，pH 7）溶解樣品使蛋白質量濃度0.2 mg/mL，取200 μL樣品溶液置于96 孔板中用酶標儀進行熒光測定。其中，起始激發波長為280 nm，掃描波長為310～500 nm，發射光帶寬20 nm，激發光帶寬10 nm。

1.4 數據統計及分析

實驗每組數據重復3次，利用Origin 8.0軟件處理數據作圖。利用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析及相關性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 共價結合率分析

圖 1 生物酶法和化學堿法條件下花青素與SPI的共價相互作用分析圖Fig. 1 Analysis of covalent interaction betweenanthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

應用反相高效液相色譜法測定花青素與SPI共價聚合物中游離花青素的含量，進而對兩種共價交聯方式下的花青素-SPI共價聚合物中共價交聯花青素含量及兩者的共價結合率進行評估。如圖1所示，在漆酶氧化條件下，花青素與SPI的共價結合率在97.0%～98.0%之間，比堿性條件下（pH 9）共價交聯的花青素與SPI的共價結合率（93.0%～95.5%）高（P＜0.05）。但總體來看，無論是在生物酶法氧化還是化學堿法氧化條件下，多酚與蛋白的共價結合率都相對較高（93.0%～98.0%），這主要是因為酚類化合物在多酚氧化酶或堿性條件下，容易被氧氣分子氧化從而形成相應的醌類物質，所得醌類可與親核試劑（蛋白質上的側鏈基團）發生親核反應以形成比較強而且穩定的共價鍵[24-25]，進而使花青素醌牢牢綁定SPI。

由圖1可知，在同一共價交聯方式下，共價交聯花青素含量隨花青素質量濃度升高而升高，這主要是因為同一共價處理條件下，不同質量濃度花青素與SPI的共價結合率幾乎相同（生物酶法：97.0%～98.0%；化學堿法：93.0%～95.5%），所以共價聚合物中花青素的質量濃度越高，共價交聯花青素含量越高。而且，圖1表明LC1共價交聯花青素含量高于AC1 3.87%，LC2高于AC2 2.58%，LC3高于AC3 4.43%。上述結果表明在漆酶氧化條件下，花青素與SPI可以發生更強的共價相互作用。由此，推測其原因是在氧氣存在的情況下，多酚氧化酶（漆酶）可以更完全地氧化花青素形成相應的花青素醌。

2.2 游離巰基含量分析

圖 2 生物酶法和化學堿法條件下花青素與SPI的共價相互作用對蛋白游離巰基含量的影響

蛋白質中的巰基基團具有很高的反應活性，對蛋白質的結構和功能特性有重要影響[26]。如圖2所示，使用生物酶法與化學堿法共價交聯花青素與SPI后，明顯降低了SPI的游離巰基含量（P＜0.05）。同時，隨著花青素質量濃度升高，所有樣品的游離巰基基團含量呈現持續降低趨勢。尤其是在多酚氧化酶（漆酶）存在的條件下，當花青素質量濃度為0.5 g/L時，相比較于天然SPI，樣品的游離巰基含量降低了66.73%，并且其降低程度明顯高于同質量濃度花青素在堿性條件下對SPI游離巰基含量的影響（P＜0.05）。這是因為在生物酶法氧化（pH 7）和化學堿法氧化（pH 9）條件下，花青素容易被氧化為相應的醌，其醌類物質能夠與SPI側鏈的游離巰基基團發生親核反應，從而形成C—S鍵，進而使SPI的游離巰基基團的含量降低[27]，而且在生物酶法條件下，花青素能夠更加完全地被氧化成相應的醌，從而與SPI發生更強的共價交聯，更大程度地降低了SPI的游離巰基含量。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

圖 3 花青素與SPI共價聚合物的傅里葉紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of for the covalent conjugates of anthocyanin and SPI

傅里葉變換紅外光譜法是一種研究蛋白質二級結構構象變化的常用技術[28]，其中酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）紅外吸收峰的變化可以反映蛋白質二級結構的變化。研究文獻表明，蛋白質二級結構與各子峰間波數的對應關系為：α-螺旋：1 646～1 664 cm-1；β-折疊：1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1；β-轉角：1 664～1 681 cm-1；無規卷曲：1 637～1 645 cm-1。圖3顯示了天然SPI以及不同質量濃度花青素-SPI共價聚合物的傅里葉紅外光譜圖，如圖3A和圖3B所示，不同質量濃度花青素的添加都降低了SPI酰胺I帶的吸光度，并且致使SPI酰胺I帶的紅外吸收峰發生不同程度的藍移，這表明不同質量濃度花青素對SPI的共價交聯作用不同程度地改變了蛋白質的二級結構[29]。當花青素質量濃度為0.5 g/L時，將生物酶法和化學堿法兩種共價交聯方式下的花青素-SPI共價聚合物與天然SPI的傅里葉紅外光譜圖進行比較。如圖3C所示，在添加同質量濃度（0.5 g/L）的花青素條件下，不同共價交聯方式處理花青素與SPI致使天然SPI酰胺I帶的紅外吸收峰發生藍移的程度也不同（生物酶法：1 634.38 cm-1藍移至1 631.97 cm-1；化學堿法：1 634.38 cm-1藍移至1 632.93 cm-1），這表明不同共價交聯方式可以不同程度地改變蛋白質的二級結構。

同時利用peakfit對蛋白的酰胺I帶進行去卷積，二階求導，采用Gauss面積法擬合曲線并計算得出蛋白質二級結構的種類與含量[29]，計算結果見表1。

表 1 花青素-SPI共價聚合物中蛋白的二級結構含量Table 1 Contents of protein secondary structures in the covalent conjugates of anthocyanin and SPI %

如表1所示，與天然SPI相比，所有添加花青素樣品的SPI的二級結構含量都發生了改變，其中α-螺旋和β-折疊含量降低，β-轉角和無規卷曲含量明顯升高（P＜0.05），這可能是由于蛋白質的α-螺旋和β-折疊逐漸轉換為β-轉角和無規卷曲。這與之前的研究[30]結果一致。在添加同質量濃度花青素條件下，生物酶法交聯得到的花青素-SPI共價聚合物比化學堿法交聯得到的聚合物增加β-轉角和無規卷曲含量的趨勢更加明顯（P＜0.05），這表明生物酶法共價交聯作用比化學堿法共價交聯作用解折疊蛋白質二級結構的能力更強，可以更大程度地使部分蛋白結構展開[15]。

2.4 紫外-可見光譜分析

圖 4 生物酶法和化學堿法條件下花青素與SPI共價聚合物的紫外-可見吸收光譜圖Fig. 4 UV-Vis absorption spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白質的吸收光譜在290 nm左右處有一個主要的吸收峰，代表蛋白質的芳香族氨基酸π-π*躍遷[31]。如圖3所示，花青素的添加使SPI的紫外-可見吸收光譜峰值升高，且在同一種共價交聯方式條件下，SPI的吸收光譜峰值隨花青素的質量濃度升高而增加。但在同一質量濃度花青素條件下，生物酶法交聯的花青素-SPI共價聚合物比化學堿法交聯的聚合物峰值高。值得注意的是，花青素的添加不僅改變了SPI吸收光譜的峰值，而且使得SPI的紫外吸收光譜在290 nm波長處的峰位發生了藍移，尤其在花青素質量濃度為0.5 g/L，生物酶法交聯的聚合物峰位藍移最為明顯，由波長290 nm藍移至287 nm。

研究表明，蛋白質吸收峰峰值的大小主要反映了蛋白質分子與其他小分子的相互作用的強弱，而蛋白質吸收峰峰位的改變主要是由于蛋白質微環境的疏水性發生改變所引起的，并且蛋白質微環境疏水性的改變會引起蛋白質構象的變化[13]。根據圖4結果可知，花青素使SPI芳香族氨基酸處的微環境發生了改變，進而誘導SPI多肽鏈伸展，發生解折疊。同一共價交聯方式下，隨著花青素質量濃度升高，花青素與SPI的共價相互作用越強；而同一質量濃度花青素條件下，生物酶法交聯比化學堿法交聯更能促進花青素與SPI的共價相互作用。

2.5 熒光光譜分析

圖 5 生物酶法和化學堿法條件下花青素與SPI共價聚合物的熒光光譜圖Fig. 5 Emission fluorescence spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白質被認為具有固有的發射熒光，主要是由于它們的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基。激發波長為280 nm時，苯丙氨酸可以忽略，當這些芳香族殘基暴露于不同的溶劑條件下時，熒光發射光譜特征會改變[13]。如圖5所示，花青素與SPI的共價交聯使得SPI的熒光強度發生了猝滅現象，并且花青素質量濃度越高，SPI的熒光強度猝滅現象越明顯。同一花青素質量濃度，生物酶法條件下花青素對SPI熒光強度的猝滅程度高于化學堿法條件。這說明生物酶法條件下和化學堿法條件下花青素與SPI發生了相互作用，可能是因為花青素氧化形成的醌類物質上的C與SPI芳香族氨基酸的自由氨基（—NH2）的N發生親核反應形成C—N鍵，從而導致蛋白發色基團的減少，使得SPI的熒光強度下降，并且兩者在生物酶法條件下的相互作用強于在化學堿法條件下的反應。而且不同質量濃度花青素對SPI的交聯使得SPI的λmax發生不同程度的紅移，使其從328 nm紅移至334 nm，這表明花青素與SPI的共價相互作用誘導蛋白的三級結構發生解折疊，并且使得SPI的主要發色基團色氨酸暴露于較為親水環境中[32]。

3 結 論

本實驗采用生物酶法和化學堿法共價交聯花青素與SPI，運用不同的色譜和光譜手段探究兩種共價交聯方式對SPI結構的影響。研究得出以下結論：1）加入同質量濃度花青素，相較于化學堿法來說，生物酶法共價處理使花青素與SPI的結合率更高。2）花青素對SPI的共價交聯降低了蛋白質中的游離巰基含量，且花青素質量濃度越高，樣品中游離巰基含量越少；生物酶法交聯的花青素-SPI共價聚合物比化學堿法交聯的聚合物巰基含量少。3）傅里葉變換紅外光譜表明共價交聯處理下，隨著花青素質量濃度升高，蛋白α-螺旋和β-折疊含量逐漸降低，β-轉角和無規卷曲含量逐漸升高，花青素進而誘導蛋白質解折疊，而生物酶法處理的樣品中蛋白質二級結構含量的改變比化學堿法更明顯。4）紫外-可見吸收光譜和熒光光譜表明花青素對SPI的共價交聯使得SPI的紫外吸收值升高，熒光強度下降、最大吸收波長發生改變，而上述趨勢，生物酶法交聯的花青素-SPI共價聚合物展現的更為顯著，這表明花青素可以改變SPI芳香族氨基酸殘基的微環境，使SPI多肽鏈解折疊，進而使其三級結構構象發生改變，而同質量濃度花青素下，生物酶法較化學堿法使得花青素與SPI共價相互作用更強，花青素能更大程度地改變蛋白質的三級結構。

以上結果為生物酶法和化學堿法處理花青素與SPI對蛋白結構產生影響的差異提供了部分參考，使多酚與蛋白復合食品的合理應用有一定的理論依據。