乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法

張娜娜，劉 洋,*，俞 漪，趙 渝，竇同海，徐 瓊，段文鋒，翁史昱

（1.上海市質量監督檢驗技術研究院，國家食品質量監督檢驗中心（上海），上海 200233；2.上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234；3.復旦大學生命科學學院，上海 200438；4.上海市質量管理科學研究院（上海），上海 200050）

嗜酸乳桿菌是重要的益生菌，被大量應用在食品中[1]。研究表明嗜酸乳桿菌能在乳制品中產生乳酸，并能通過氨基酸代謝增加風味[2-3]。嗜酸乳桿菌主要作用有降低pH值、產生抗菌素（如嗜酸菌素和乳酸殺菌素等），在一定程度上抑制腸道中有害微生物的有害作用[4-6]。有研究[7-9]發現嗜酸乳桿菌對大腸桿菌、腹瀉致病菌等均有抑制作用；大量的嗜酸乳桿菌還可阻礙膽固醇的合成，降低血漿中膽固醇含量[10]；另外對于乳糖不耐癥也有一定的療效[11-12]。嗜酸乳桿菌對腸道菌群的平衡和對微生態的調節也證明其對健康具有促進的作用[13-14]。在我國，飲料中添加益生菌特別是嗜酸乳桿菌成為新的發展趨勢[15-16]。

關于益生菌的使用我國發布了一系列的法律法規，2016年，衛計委關于印發《可用于食用的菌種名單》的通知（衛辦監督發[2010]65號）[17]，規定食品中允許使用的菌種。2013年衛生部發布關于食品中使用菌種標簽標識有關問題的復函（衛辦監督函[2013]367號）[18]中明確指出，預包裝食品中使用了上述菌種的，應當按照GB 7718—2011《預包裝食品標簽通則》[19]的要求標注其菌種名稱，企業可同時在預包裝食品上標注相應的菌株名、菌株號和活菌量。2016年制定了關于乳酸菌檢測方法的標準GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》并在GB 7101—2015《飲料》規定乳酸菌飲料產品標簽應標明活菌或非活菌，標識活菌的其活菌數至少要達到1×106CFU/mL[20-21]。標準檢測方法操作復雜、結果判讀時間長，很難滿足市場快速檢測的要求。為防止市場上出現濫竽充數的情況，建立基于分子水平的菌種特異性鑒定方法十分重要[22]。

目前在DNA水平上的分子檢測方法越來越多，其檢測方法快速方便、靈敏、省時被廣泛應用到物種檢測中[23]。其中實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術因其高特異性、高靈敏度、無污染等優點，在食品檢測中備受青睞。本研究建立基于嗜酸乳桿菌SPIDR保守區域的序列結合實時熒光定量PCR方法定量檢測飲料中的嗜酸乳桿菌，以保障食品安全監管順利進行。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

據2016年衛計委發布，衛辦監督發《可用于食品的菌種名單》[7]與市場上常見的乳酸菌菌株及可能存在的致病菌，本研究所選菌株為嗜酸乳桿菌4 株，非嗜酸乳桿菌共17 株，其中包括乳桿菌14 株，嗜熱鏈球菌、大腸桿菌以及沙門氏菌各1 株。菌株樣本見表1。菌種購買后均由上海市質量監督檢驗技術研究院自行保存。

表 1 標準菌種名稱及其編號Table 1 Information about standard strains used in this study

1.2 儀器與設備

5430R振蕩水浴槽 德國艾本德有限公司；電熱恒溫培養箱 美國Shellab公司；ESCO LA2-4A1生物安全柜 新加坡藝思高公司；7500 Fast熒光定量PCR儀美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 標準菌株及乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的培養

按照GB 4789.35—2016方法進行培養[21]。

1.3.2 乳酸菌核酸提取

改良的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法提取核酸[24]。

標準菌株核酸提?。河脽o菌棉簽沾取培養基上的菌株，在裝有無菌水的2 mL離心管中洗脫，離心，加入400 μL溶菌酶（50 ng/μL），37 ℃孵育2 h，再加入40 μL蛋白酶K（20 mg/mL）和400 μL SDS，56 ℃水浴2 h，后按照核酸提取的步驟提取核酸。

乳酸菌飲料及模擬樣品中核酸提?。簶悠坊靹?，取2 mL加入離心管中，2 000×g離心5 min，上清液移至新的離心管中，加入5 mL無菌水，混勻，沸水中放置10 min，2 000×g離心5 min，上清液移至新的離心管中，再次9 000×g離心10 min，去上清液，沉淀加入400 μL溶菌酶（50 ng/μL），37 ℃孵育2 h，再加入40 μL蛋白酶K（20 mg/mL）和400 μL SDS，56 ℃水浴2 h，后按照核酸提取的步驟提取核酸。

1.3.3 引物、探針設計

在NCBI網站上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）下載嗜酸乳桿菌NCFM基因組，利用SPIDR的保守區域序列，借助ClustalW 軟件對此序列進行比對，然后使用Primer Express 3 軟件設計引物、探針（NCFM F：5’-GTGATCTTTCCTTCACTGCGT-3’；NCFM R：5’-TCCTCGATGGTAACTCTGTAGC-3’；NCFM P：5’-FAM-TGTGCTTCAGGGTTACCTCCACTTTCABQH-3’）用于嗜酸乳桿菌的鑒定，擴增片段為213 bp，在NCBI網站上使用BLAST數據庫比對引物和探針的理論特異性。乳桿菌通用引物序列（ST16s F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；ST 1495 R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）用于擴增提取的DNA，檢驗提取物中含有核酸，作為對照。引物和探針均由英濰捷基生物公司合成。

1.3.4 PCR條件及檢測

普通PCR采用20 μL體系進行PCR擴增，其中包括10 μL TaKaRa Ex Taq mix，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，探針（5 μmol/L）0.5 μL，2 μL DNA模板，去離子水補足至20 μL。

普通PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度依次為56、58、60、62、64、60 s，72 ℃退火40 s，38 個循環；72 ℃延伸10 min。

PCR產物檢測方法：取 5 μL PCR產物，在 1.0%瓊脂糖凝膠和0.5% TE緩沖液中電泳28 min（120 V），然后采用凝膠成像系統拍照存檔。

1.3.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR體系為20 μL，包含TaKaRa Prober Taq mix 10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，探針（5 μmol/L）0.5 μL，2.0 μL DNA 模板，去離子水補足至20 μL。采用實時熒光定量PCR系統進行擴增。反應參數：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，40 個循環。

1.3.6 檢測方法的特異性、靈敏度和重復性測試

特異性測試：采用4 株嗜酸乳桿菌菌株，14 株近緣乳桿菌，以及3 株其他細菌的核酸為模板，采用建立的實時熒光定量PCR體系進行檢測。

靈敏度測試：包括相對靈敏度和絕對靈敏度的檢測。絕對靈敏度測試選取4 株嗜酸乳桿菌，分別將提取的核酸溶液進行稀釋，核酸質量濃度依次為58、5.8、0.58、0.058、0.005 8、0.000 58、0.000 058 ng/μL，進行熒光擴增。相對靈敏度測試將嗜酸乳桿菌ATCC4356培養液進行稀釋提取的核酸為模板，采用建立的實時熒光定量PCR體系進行檢測。靈敏度的檢測每個質量濃度設置6 個平行，實驗重復3 次，最終滿足不小于96%置信區間的要求。

重復性測試：采用嗜酸乳桿菌ATCC4356標準菌株核酸的6 個質量濃度的梯度稀釋液進行擴增，每個質量濃度4 個平行，計算Ct值的標準偏差（standard deviation，SD）和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 實時熒光定量PCR體系的抗干擾能力檢測

對建立的實時熒光定量PCR體系抗干擾能力測試包括培養物水平抗干擾能力檢測和核酸水平抗干擾能力檢測。核酸水平是將提取的嗜酸乳桿菌ATCC4356核酸稀釋至58、5.8、0.58、0.058、0.0058、0.000 58 ng/μL，分別添加300 pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922核酸，對制備的混合核酸模板進行實時熒光定量PCR擴增；培養物水平是將嗜酸乳桿菌ATCC4356培養至108CFU/mL后依次稀釋至10 CFU/mL，然后添加濃度為104CFU/mL和106CFU/mL的大腸桿菌ATCC25922，并提取核酸。每個濃度2 個平行，每個樣品重復3 次。

1.3.8 模擬樣品檢測

利用建立好的實時熒光定量PCR技術對模擬樣品進行檢測，模擬樣品的制作：嗜酸乳桿菌ATCC4356培養至109CFU/mL，以市場上購買不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料作為基質，進行梯度稀釋，最終將稀釋液進行核酸提取，以該核酸為模板擴增。每個濃度進行5 個平行。

1.3.9 實際樣品檢測

市場上隨機購買樣品共11 份，其中5 份樣品的標簽標記不含嗜酸乳桿菌，6 份樣品標記含有嗜酸乳桿菌，按建立的實時熒光定量PCR方法對樣品進行檢測。每個樣品3 個平行。

1.4 數據與圖像處理

實驗使用的儀器自帶軟件7500 Fast System Software v1.3.2在擴增過程中自動進行分析并得出Ct值，統計學分析則借助SPSS 14.0進行。

2 結果與分析

2.1 普通PCR的溫度優化

利用普通PCR進行溫度優化，擴增溫度分別選擇56、58、60、62、64 ℃幾個梯度，結果如圖1所示，擴增效率最高的是60 ℃，后續實驗選擇60 ℃為體系的擴增溫度。

圖 1 普通PCR擴增溫度優化Fig. 1 Optimization of amplification temperature through traditional PCR

2.2 實時熒光定量PCR方法的特異性

圖 2 實時熒光定量PCR特異性Fig. 2 Specificity of real-time fluorescence quantitative PCR

如圖2A所示，所有嗜酸乳桿菌的標準菌株均有明顯擴增，且Ct值在16～18之間，其他菌株均無明顯的擴增；如圖2B所示，采用乳桿菌通用引物對所有菌株進行擴增時，可見到清晰的擴增條目。證明本研究建立的實時熒光定量PCR檢測方法對于嗜酸乳桿菌有較好的特異性。

2.3 檢測方法的靈敏度

2.3.1 實時熒光定量PCR方法的絕對靈敏度

表 2 實時熒光定量PCR檢測的絕對靈敏度Table 2 Aabsolute sensitivity of real-time fluorescence quantitative PCR

如表2所示，嗜酸乳桿菌ATCC4356、CICC6082、NCFM、La-14可穩定檢測的最低質量濃度為0.000 58 ng/μL。每個模板添加4 μL，即檢測限在3 pg左右，本研究的實時熒光定量PCR體系的絕對靈敏度達到3 pg。

2.3.2 實時熒光定量PCR的相對靈敏度

表 3 實時熒光定量PCR的相對靈敏度Table 3 Relative sensitivity of real-time fluorescence quantitative PCR

相對靈敏度檢測是將嗜酸乳桿菌ATCC4356的培養液按照10 倍梯度稀釋法從108～102CFU/mL各濃度取1 mL提取核酸，然后進行實時熒光定量PCR擴增。由表3可以看出，嗜酸乳桿菌ATCC4356的絕對靈敏度可穩定檢出的最低濃度為103CFU/mL。根據絕對靈敏度和相對靈敏度的檢測可得出實時熒光定量PCR的檢測限為103CFU/mL。

2.4 實時熒光定量PCR方法的重復性檢測結果

表 4 實時熒光定量PCR的重復性檢測Table 4 Rrepeatability of real-time quantitative PCR

如表4所示，嗜酸乳桿菌ATCC4356不同的核酸濃度擴增，每個質量濃度6 個平行，最終實驗結果Ct值的SD介于0.14～0.56之間，RSD介于0.862%～2.55%之間，均在可接受范圍內。證明建立的實時熒光定量PCR方法重復性較好。

2.5 實時熒光定量PCR方法的抗干擾能力

表 5 實時熒光定量PCR在培養物水平上的抗干擾能力Table 5 Anti-interference ability of real-time fluorescence quantitative PCR against E. coli culture

表 6 實時熒光定量PCR純基因水平上的抗干擾能力（Ct值）Table 6 Anti-interference ability of real-time fluorescence quantitative PCR against E. coli genome

在實際檢測中，樣品中的菌株一般是目標菌和其他菌株的混合物，因此在培養物水平進行檢測可以排除樣品中或在提取過程中混入雜菌的可能性；在純基因水平進行抗干擾能力的檢測可以排除在擴增過程中出現交叉污染的情況。由表5可以看出，在樣品中混入103、106CFU/mL的雜菌對實時熒光定量PCR的擴增是沒有干擾的，且檢出限仍為103CFU/mL；由表6可以看出，在不同濃度的嗜酸乳桿菌ATCC4356的核酸中添加300 pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922的核酸提取物，各濃度梯度核酸檢出的Ct值均未受影響，證明建立的實時熒光定量PCR擴增體系抗干擾能力強。

2.6 模擬樣品的檢測及標準曲線

為驗證建立的方法是否可以在實際樣品中進行檢測，在進行實樣檢測之前，利用模擬樣品對該方法進行驗證。這樣不僅可以節約時間，且節省成本在不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料為基質的模擬樣品檢測中，以Ct值為縱坐標，以嗜酸乳桿菌標準株已知的不同稀釋菌數對數值（lg（CFU/g））為橫坐標建立標準曲線，得出線性方程為y=-3.312 4x+38.939，R2=0.987，檢測結果的線性較好且檢測限仍為103CFU/mL。說明本實驗建立的實時熒光定量PCR的檢測方法可行，且檢測的結果與實際添加量是一致的。

2.7 實際樣品檢測結果

對市售的11 份樣品采用建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測，利用乳桿菌通用引物進行擴增，樣品核酸全部擴增出目的條帶，表明樣品中已提出可擴增的DNA；采用嗜酸乳桿菌屬的特異性引物、探針擴增，含有嗜酸乳桿菌的6 份乳酸菌飲料全部擴增出目標條帶，定量檢測結果表7所示。

表 7 實際樣品的實時熒光定量PCR檢測結果Table 7 Detection of actual samples by real-time fluorescence quantitative PCR

由表7可以看出，11 份樣品中，6 份樣品檢測出含有嗜酸乳桿菌，編號分別為B1、B4、B6、B7、B8、B9，這與購買樣品的便簽信息一致。檢測結果可以看出，嗜酸乳桿菌的含量在5.83×102～3.68×104CFU/mL之間，建立的實時熒光定量PCR方法可以用砸乳酸菌飲料中對嗜酸乳桿菌進行定量。

3 討論與結論

乳酸菌飲料中添加嗜酸乳桿菌的產品越來越多，且價格較高，利益驅使下可能會出現“濫竽充數”的現象，值得監管部門重視。我國衛生部曾發布相關標準規定：乳酸菌飲料中益生菌活菌的添加量要不低于106CFU/mL。目前對于乳酸菌飲料特別是非活菌飲料中益生菌的菌種鑒定、益生菌定量檢測缺少快速、準確、特異性、高通量的檢測方法。

傳統方法一般依賴于國家標準對嗜酸乳桿菌進行檢測，即基于培養法，耗時耗力，結果受操作者經驗影響較大，難以滿足市場精確鑒定和定量的要求。利用分子生物法進行檢測的手段已在食品微生物檢測中得到應用[25-28]。Guo Zihao[29]和包秋華[30]等研究了發酵食品中嗜酸乳桿菌的檢測技術，有研究表明利用熒光定量PCR方法對發酵乳中的乳酸菌或雙歧桿菌進行檢測，并與平板計數法進行比較，結果顯示PCR法與平板法技術結果相符[31-33]。這些均證明實時熒光定量PCR可以在乳酸菌飲料的檢測中應用，且具有快速、通量高、重復性高等優點。目前，國內外對嗜酸乳桿菌的定性定量檢測研究報道較少。本實驗建立乳酸菌飲料中添加嗜酸乳桿菌的定性定量檢測方法，對方法的特異性、靈敏度、重復性、抗干擾能力等多方面參數進行研究，結果表明該方法具有很強的實用性。

本研究利用設計的嗜酸乳桿菌屬的特異性引物建立實時熒光定量PCR方法在乳酸菌飲料中的檢測應用。結果證明，該方法的特異性好，檢測限低，純基因水平檢測限在3 pg左右，絕對靈敏度檢測達到103CFU/mL，且重復性較好；在純基因水平與培養物水平的抗干擾能力都很強；模擬樣品檢測中其檢測限未改變，重復性較好，證明適合在市場檢測中使用；實際樣品檢測結果與標簽信息一致。并得出嗜酸乳桿菌相應的添加量，只是嗜酸乳桿菌的含量有所不同。這一研究證明該方法可應用在乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的快速檢測。