豬肉12-脂肪氧合酶催化結構域的表達、純化及其酶學性質分析

王晶晶，王 婷，張新笑，卞 歡，耿志明，李鵬鵬,*，王道營，徐為民,3

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農業大學肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）屬于氧化還原酶[1]，是一種含非血紅素鐵的雙加氧酶。LOX專一性作用于多不飽和脂肪酸的順,順-1,4-戊二烯基位置，通過分子內加氧，生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物[2]。LOX在生物體內的主要作用底物是亞麻酸、亞油酸和花生四烯酸，依據其加氧位置的特異性，將LOX分為5-LOX、8-LOX、9-LOX、10-LOX、11-LOX、12-LOX、13-LOX、15-LOX，其中15-LOX廣泛存在于動植物、細菌和真菌中[3-5]。15-LOX對脂肪酸的作用底物除了亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸，還可以是磷脂、膽固醇脂，甘油三脂等含有不飽和脂肪酸以及更復雜的脂質蛋白質分子。豬的白血球型12-LOX與人的網織紅細胞15-LOX相近，既能催化C-12氧化，也可催化C-15氧化，15-LOX的最適底物為亞油酸并且催化C-13氧化[6-7]。

Andre等[8]于1932年首次發現酶促氧化反應是大豆制品的豆腥味的主要來源，其中的關鍵酶即LOX。Fu Xiangjin等[9-10]研究證實白鰱魚在貯藏和加工過程中出現的腥味增強主要是由白鰱魚體內的LOX催化降解不飽和脂肪酸產生的各種醛類物質引起的。此后，人們對LOX在食品加工貯藏過程中對風味的影響進行了廣泛研究。研究表明，LOX氧化多不飽和脂肪酸生成的氫過氧化物極不穩定，進一步反應生成多種揮發性化合物，這些物質一方面形成食品的主要風味物質，例如新鮮水果蔬菜的風味物質醛類即由LOX氧化多不飽和脂肪酸途徑生成[11-12]，干腌肉制品的主要風味物質己醛也是脂質氧化降解生成[13-14]；另一方面，食品中脂質的過度氧化產生刺激性氣味物質，不僅導致食品風味劣變，還造成食物多不飽和脂肪酸含量下降，導致食物營養品質的下降并增加食品儲藏的困難[15-20]。脂類物質的氧化分為自動氧化和酶促氧化[21]，LOX是酶促氧化最主要的內源酶。Gata等[22]通過硫酸銨沉淀、DEAE陰離子交換和疏水層析等純化步驟從豬股二頭肌中分離得到一種LOX，對其性質的研究表明LOX可能參與伊比利亞火腿的風味形成。Jin Guofeng等[23]研究表明LOX在干腌培根加工過程中的脂肪氧化起重要作用，溫度、酸度和鹽含量是影響LOX活力的主要因素。研究LOX在肉品脂質氧化過程中的作用及其影響因素，對調控肉品風味品質具有重要的理論和實踐意義。

盡管人們早已認識到LOX在肉品加工中的潛在應用價值，但從豬肉中直接獲得不僅得率低而且純化難，獲得LOX純酶的成本很高；通過LOX基因的克隆與表達，經簡單的純化過程，獲得高純度的LOX，能有效解決上述問題[23]。至今為止，還未曾有體外重組表達豬肉LOX的報道。為更好地研究豬肉加工和貯藏過程中風味物質的產生機理和途徑，研發新型工藝，既保留風味物質又能保持豬肉加工過程中的品質和營養價值。豬肉12-LOX的編碼基因序列已在GenBank公布（GenBank登錄號M31417.1）。豬肉12-LOX包括兩個結構域：N端的β桶結構域屬于C2家族蛋白，主要負責12-LOX與膜的結合；C端的催化結構域。本研究以豬肉為原料，從中獲取12-脂肪氧合酶催化結構域（12-lipoxygenase catalytic domain，12-LOXcd）的編碼基因，對該酶進行提取純化，并對其酶學性質進行研究，與大豆LOX的酶學性質進行比較，因為大豆中LOX含量與活力較高且研究較多，為豬肉制品的加工和貯藏加工提供技術和數據支持[24]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α 南京擎科生物工程有限公司；大腸桿菌表達載體pMBP 本實驗室保藏；TransStart?FastPfu DNA Polymerase試劑盒、大腸桿菌TranSetta2 北京全式金生物技術有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨 美國Oxoid公司；瓊脂粉 南京奧多福尼生物科技有限公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素、卡那霉素 上海生工生物股份有限公司；亞油酸、大豆脂氧酶（15 MU）美國Sigma公司；pMD19-T 載體、反轉錄試劑盒、限制性內切酶、T4 DNA連接酶 寶生物工程（大連）有限公司；TEV蛋白酶 本實驗室制備；其他試劑為國產分析純。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。加水溶解后，加水定容到1 000 mL。配制固體培養基時，每100 mL加入瓊脂粉1.5 g。

1.2 儀器與設備

UV-6100型分光光度計 上海美普達儀器有限公司；TP600梯度升降溫功能聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海天呈醫流科技股份有限公司；M124A分析天平 意大利BEL公司；ZEALWAY（致微）G154DWS滅菌器 廈門儀器有限公司；Mini-PROTEANTetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽 北京六一儀器廠；AKTA蛋白純化系統 美國GE Healthcare公司；BioTekSynergy2多功能酶標儀 美國BioTek公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司；Tanon-1600全自動凝膠成像分析儀 上海天能儀器有限公司；VD-650超凈工作臺 蘇州江東精密儀器有限公司；ZQTY-90S臺式全溫振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

由NCBI公布的豬肉基因組12-LOX基因預測序列，篩選到該基因的CDS序列，運用Primer 5.0設計基因的特異性引物。上游引物（F）：5’-TTCCATATGGGCACTGCCCGCACA-3’（下劃線是NdeI酶切位點）；下游引物（R）：5’-CGCTCGAGGATGGCCACACTGTTT-3’（下劃線是XhoI酶切位點）。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 總RNA提取及cDNA合成

豬肉總RNA的提取根據TaKaRa公司的TRIzol說明書進行操作。取豬腿肉100 mg，提取總RNA，總RNA經電泳檢測，Eppendorf公司核酸定量分析儀測定OD260nm/OD280nm比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書進行反轉錄。反轉錄程序：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存，若要長期保存則應放于-20 ℃。

1.3.3 目的基因的獲得

以cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系為50 μL，其中模板1 μL，上、下游引物各1 μL，5×TransStart?FastPfu Buffer 10 μL，TransStart?FastPfu DNA Polymerase 1 μL，5×激活劑5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，ddH2O 27 μL。擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃、20 s；60 ℃、20 s；72 ℃、90 s，進行35 個循環；72 ℃延伸30 s。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物進行純化回收，連接至pMD19-T載體，轉化至DH5α感受態細胞，取少量菌液涂在含氨芐青霉素的固體培養基上，37 ℃培養過夜，然后挑取陽性單菌落進行培養，經菌落PCR和酶切鑒定，將連接正確的重組基因質粒送至南京生物工程股份有限公司測序。

1.3.4 重組表達載體的構建

凝膠回收的PCR產物以及原核表達載體pMBP分別用NdeI和XhoI在37 ℃條件下雙酶切2 h，再分別進行切膠純化回收后，用T4連接酶連接（22 ℃，2 h），將重組質粒全部轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞。涂布于含有卡娜青霉素的LB平板，倒置，37 ℃培養過夜。挑取單菌落進行菌液PCR鑒定是否構建成功，篩選出陽性重組質粒并送至南京生物工程股份有限公司測序。

1.3.5 融合蛋白的原核表達及可溶性分析

經過鑒定正確的重組質粒轉化到大腸桿菌TranSetta2感受態細胞，過夜培養后挑取單菌落接種至5 mL含100 μg/mL卡那青霉素的LB培養基中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養，當菌液濃度OD600nm值為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，22 ℃、200 r/min誘導過夜。離心收集沉淀，1∶5的比例加入緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽，pH 7.6，120 mmol/L NaCl）重懸菌體，于超聲波細胞破碎儀上破碎10 min（80 W，φ 2，開1 s，停3 s），取出40 μL作為總菌后12 000 r/min、4 ℃離心5 min，分別取出上清液、沉淀40 μL，加入10 μL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min。用12% SDS-PAGE檢測融合蛋白是否為可溶性蛋白，設置不加IPTG誘導的菌液作為對照。

1.3.6 重組融合蛋白的誘導表達及純化

將上述鑒定能可溶性表達12-LOXcd的菌落接種于1 L含卡那青霉素的LB液體培養基中進行誘導表達，同時接種1 L含氨芐青霉素的LB液體培養基（Tev-nohis）。分別離心（4 000 r/min，20 min）收集菌體，用Binding Buffer（20 mmol/L磷酸鹽，pH 7.6，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，10%甘油）重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎30 min（功率150 W，超聲1 s，間停3 s），再離心（12 000 r/min，20 min，4 ℃）收集上清液，棄菌體沉淀，將兩個菌液的上清液混勻后放4 ℃酶切24 h，切除麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein，MBP）。24 h后，上清液12 000 r/min、4 ℃離心20 min，留上清液。鎳柱平衡后將上清液加入鎳親和層析柱中，分別用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，初步純化目的蛋白，取收集的樣液加入SDS-PAGE上樣緩沖液，加熱（95 ℃，10 min），用12% SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況。將較純的樣品用10 kDa的超濾管離心濃縮（4 ℃，3 500×g，10 min/次）。最后用Superdex G200進一步純化，然后再次用SDS-PAGE檢測純化的產物并離心濃縮。用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后置于-80 ℃保存。

1.3.7 豬肉12-LOXcd、大豆LOX活力測定及酶學性質比較

1.3.7.1 底物溶液配制

0.5 mmoL亞油酸溶于5 mL含180 μL Tween 20的脫氧重蒸水中，充分混勻；滴加1 mol/L NaOH溶液充分混勻使體系成為清澈透明的液體，再用1 mol/L HCl溶液調pH值至9.0，最后用脫氧重蒸水定容至50 mL。將配制好的亞油酸儲備液分裝保存在EP管中，并于-20 ℃下貯存[25]。

1.3.7.2 酶活力測定

豬肉12-LOXcd活力測定在Kermasha等[26]的方法基礎上進行改進。取200 μL亞油酸底物儲備液與2.9 mL、50 mmol/L的檸檬酸緩沖液（pH 5.5）充分混合，待其在234 nm波長處的吸光度穩定后，加入100 μL酶液（稀釋10 倍），迅速混合，于234 nm波長處測定其1.0 min內吸光度的增加量。以200 μL亞油酸底物儲備液與2.9 mL檸檬酸緩沖液混合為空白。

LOX活力定義[27]：在一定的溫度和pH值條件下，反應體系在234 nm波長處每分鐘吸光度增加0.001表示為1 個酶活力單位（U）。

1.3.7.3 最適pH值及其pH值穩定性

按1.3.7.2節所述，在37 ℃下利用pH 4.0～10.0系列緩沖溶液分別替代反應體系中的50 mmol/L、pH 5.5檸檬酸緩沖溶液測定酶活力，以酶活力最高值為100%，計算不同pH值下的相對活力，分析不同pH值對酶活力的影響情況。pH值為4.0、5.0、6.0緩沖液用50 mmol/L的檸檬酸和檸檬酸三鈉配制；pH 7.0、8.0緩沖液用50 mmol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制；pH 9.0、10.0緩沖液用50 mmol/L甘氨酸和NaOH配制。

進一步考察酶pH值穩定性。將酶液分別置于上述不同的pH值緩沖液中，于37 ℃下孵育1 h，取出測定酶活力，以酶活力初始值為100%，計算不同pH值下的殘留活力。

1.3.7.4 最適溫度及熱穩定性

按1.3.7.2節所述，分別在10、20、30、40、50、60、70 ℃測定豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力，以酶活力最高值為100%，計算不同溫度下的相對活力。

進一步考察豬肉12-LOXcd、大豆LOX在不同溫度下的穩定性。將酶液分別置于10、20、30、40、50、60 ℃下保存30 min，取出測定酶活力，以酶活力最高值為100%，計算不同溫度下酶的殘留活力。

1.3.7.5 NaCl添加量對酶活力的影響

用最適pH值下的緩沖液分別配制0%、1%、3%、5%、7%、9%的NaCl溶液。然后在室溫條件下按1.3.7.2節方法所述進行酶活力測定。

1.3.8 豬肉12-LOXcd的底物特異性

分別以不同濃度的亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸為底物，采用雙倒數作圖法求得不同底物的Km，比較豬肉12-LOXcd對不同底物的親和力。

1.4 數據統計及分析

采用凝膠成像儀對電泳圖進行分析。每組實驗做3個平行，酶活力圖采用Origin 8.0進行數據分析，測定結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 豬肉12-LOXcd基因原核表達載體的構建

圖 1 pMBP-12-LOXcd融 合蛋白示意圖（A）、12-LOXcd基因擴增結果（B）及重組質粒的酶切鑒定（C）Fig. 1 Schematic demonstration of pMBP-12-LOXcd fusion protein (A),PCR-amplified 12-LOXcd (B) and identification of recombinant plasmid pMBP-12-LOXcd by enzymatic digestion (C)

初期研究發現12-LOXcd蛋白在大腸桿菌中表達以包涵體形式存在，包涵體形式表達蛋白質的氨基酸不能形成正確的空間結構，影響蛋白的活性，如果對包涵體蛋白進行變性復性等操作，使蛋白活性丟失，影響后續研究和應用。經過多次實驗發現，使用MBP作為分子伴侶蛋白與12-LOXcd融合表達可以有效解決蛋白以包涵體形式在大腸桿菌中表達的問題[28]，因此本研究將MBP的編碼基因malE通過基因重組技術構建入普通表達載體中，并同時引入了TEV酶切位點（圖1A），便于后續切除融合蛋白N端的MBP。

以獲得的cDNA為模板，擴增得到的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后可見1 656 bp處的片段（圖1B），條帶大小符合預期。預測12-LOXcd編碼553 個氨基酸，分子質量為62 kDa。

將構建成功的重組質粒用NdeI和XhoI雙酶切鑒定（圖1C），得到約5 400 bp的大片段和約1 700 bp的小片段，分別與pMBP和12-LOXcd基因大小相符。進一步測序結果均準確無誤，表明目的基因已成功克隆至表達載體pMBP中，重組表達質粒構建成功，命名為pMBP-12-LOXcd。

2.2 豬肉12-LOXcd重組蛋白誘導表達及可溶性檢測結果

如圖2所示，第1泳道即未加IPTG誘導劑的重組菌在預期大小的條帶處沒有明顯的表達條帶出現；第4泳道明顯看出該系統能大量可溶性表達融合pMBP-12-LOXcd蛋白，大小約100 kDa（12-LOXcd 62 kDa和MBP 40 kDa），與預期大小一致。

2.3 重組蛋白的純化

2.3.1 豬肉12-LOXcd重組蛋白的初步純化

融合pMBP-12-LOXcd蛋白在純化前進行TEV蛋白酶切，SDS-PAGE顯示成功將MBP標簽切除，得到C端帶有His標簽的12-LOXcd蛋白（～62 kDa），采用Ni-NTAAgarose親和層析純化。收集不同咪唑濃度緩沖液洗脫得到的組分，進行SDS-PAGE檢測。圖3結果顯示，通過20 mmol/L和50 mmol/L咪唑洗脫可去除較多雜蛋白，100 mmol/L和250 mmol/L的咪唑洗脫可得到較純的12-LOXcd重組蛋白，說明可以用此方法純化目的蛋白。將100 mmol/L和250 mmol/L咪唑洗脫收集得到的蛋白用截留分子質量為10 kDa的超濾管進行濃縮，為下一步凝膠過濾層析做準備。

2.3.2 12-LOXcd重組蛋白的凝膠過濾層析

圖 4 12-LOXcd凝膠過濾層析色譜圖及SDS-PAGE圖譜Fig. 4 Gel filtration chromatography and SDS-PAGE analysis of recombinant 12-LOXcd protein

如圖4所示，濃縮后的蛋白經過Superdex G200層析柱純化后得到3 個洗脫峰，分別收集不同的洗脫峰并用12% SDS-PAGE檢測。結果顯示，經凝膠過濾層析后的蛋白條帶單一，雜帶消失。圖中2號洗脫峰為目的蛋白12-LOXcd，將該洗脫峰收集的蛋白用10 kDa的超濾管濃縮后，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后放-80 ℃保存待用。

2.4 豬肉12-LOXcd、大豆LOX酶學性質的比較

2.4.1 pH值對酶活力影響及其穩定性

在室溫條件下，測定LOX在不同pH值條件下的活力，結果如圖5所示。在pH 4.0～6.0豬肉12-LOXcd活力逐漸增加，在pH 6.0時，酶活力達到最大，之后隨著pH值的升高而降低，當pH值達到10.0時，大豆LOX活力基本為0；大豆LOX與豬肉12-LOXcd有相同的變化趨勢，其最適pH值為8.0。豬肉12-LOXcd在酸性條件下酶活力較高，這與陳欣[29]、Gate[22]、何立超[25]等研究結果一致。酶的活性中心結構在不同pH值條件下會發生變化，因此隨著pH值的改變，酶與底物的結合方式和生成中間產物會發生變化，從而影響酶反應速率[30]。本實驗中，當pH值小于6.0時，隨著緩沖液pH值的升高，12-LOXcd的活性狀態可能在逐漸地向有利于催化反應發生的方向發生改變，因此隨著pH值的逐漸升高，12-LOXcd活力呈逐漸增大趨勢。

圖 5 pH值對大豆LOX和豬肉12-LOXcd活力的影響Fig. 5 Effect of pH value on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

進一步考察酶pH值穩定性，測定兩種酶在不同pH值（4.0～10.0）緩沖液體系下孵育1 h后的剩余酶活力。由圖6可知，豬肉12-LOXcd在中性和酸性條件下穩定性較差，隨著pH值的升高，豬肉12-LOXcd的穩定性明顯提高，而大豆LOX在堿性環境下穩定性較差。在pH 10條件下處理1 h，豬肉12-LOXcd的殘留活力高達初始酶活力的80%，而此時大豆LOX的殘留活力僅為初始酶活力的40%。

圖 6 大豆LOX和豬肉12-LOXcd的pH值穩定性Fig. 6 pH stability of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

2.4.2 溫度對酶活力及穩定性的影響

由圖7可以看出，豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力均呈先上升后下降的趨勢，其最適反應溫度分別為30 ℃和20 ℃。何立超等[31]研究發現櫻桃谷鴨胸肉LOX純酶的最適溫度為30 ℃，與本研究具有一致性；而王邦國等[32]研究發現白鰱魚肌肉LOX最適作用溫度為40 ℃，這與本研究結果存在一定差異，可能與不同種類的動物有關。溫度升高能夠增加反應的活化分子數，從而加快反應速率，促進酶促反應。但溫度過高導致蛋白質變形，又會使酶活力下降。在本實驗中當溫度上升到約45 ℃時，豬肉12-LOXcd活力下降至最適溫度條件下的50%以下，說明豬肉12-LOXcd蛋白質在此溫度條件下可能已經發生變性，而在溫度達到60 ℃時，酶活力基本為零。

圖 7 溫度對豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力的影響Fig. 7 Effect of temperature on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

進一步觀察兩種LOX的熱穩定性，分別在10～70 ℃條件下孵育酶液30 min，取出并立即在冰水浴中冷卻后，測定殘余脂氧合酶活力，由圖8可知，隨著溫度的升高，豬肉12-LOXcd與大豆LOX殘留活力均不斷下降，但豬肉12-LOXcd殘留活力的變化比較平緩，在40 ℃時仍保留70%以上活力；而大豆LOX的殘留酶活力急劇下降。陳欣等[29]的研究結果顯示，大豆LOX與麻鴨LOX的殘留活力均隨溫度的升高而降低，當溫度低于50 ℃時，兩者的變化不明顯，但當溫度高于50 ℃時，大豆LOX殘留酶活急劇下降，而麻鴨LOX殘留酶活力的變化則較為平緩。因此LOX在肉制品的加工應用中能夠保持一定的活力。

圖 8 豬肉12-LOXcd和大豆LOX的熱穩定性Fig. 8 Thermal stability of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

2.4.3 NaCl添加量對酶活力的影響

圖 9 NaCl添加量對豬肉12-LOXcd、大豆LOX活力的影響Fig. 9 Effect of NaCl concentration on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

由圖9可以看出，豬肉12-LOXcd活力在NaCl質量分數為1%時達到最高。繼續增加鹽分含量，酶活力略微下降，但仍能夠保持較高的活力。這與Jin Guofeng等[23]的研究結果具有一定的一致性，即在一定范圍內增加培根中鹽分含量能夠促進肌肉中脂肪的氧化，但當鹽分含量達到一定值后，若繼續增大鹽分含量又會抑制脂質氧化?？傮w而言，豬肉12-LOXcd在較高NaCl質量分數下較穩定，而大豆LOX活力則隨著NaCl質量分數的增加而持續降低。

2.5 豬肉12-LOXcd的底物特異性

以亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸作為反應的底物，根據雙倒數作圖法求得各個底物的Km,檢測豬肉12-LOXcd對不同底物的親和性。求得亞油酸的Km為0.40 mmol/L，亞麻酸Km為0.55 mmol/L，花生四烯酸Km為4.15 mmol/L。Km越小，底物親和力越大，因此豬肉12-LOXcd對亞油酸的親和性最高，這與Gata等[22]研究結果具有一致性。

3 結 論

LOX對肉品加工貯藏過程中的風味品質起重要調節作用，目前國內外研究相對較少，僅有Jin Guofeng等[23]、郇延軍[13]研究了干腌肉制品加工過程中LOX活力變化，表征了粗酶的變化及其活性；此外，Gata等[22]通過復雜的純化步驟從豬股二頭肌中分離得到一種LOX，初步研究顯示其可能參與伊比利亞火腿的風味形成。本研究運用基因重組技術將豬肉12-LOXcd基因克隆到表達載體pMBP，并導入到大腸桿菌中進行誘導表達，成功構建pMBP-12-LOXcd的大腸桿菌表達體系；通過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析，最終獲得了高純度的12-LOXcd，并對其酶學性質進行了研究。結果表明，在以亞油酸為底物時，豬肉12-LOXcd受溫度、pH值和NaCl質量分數的調節，其最適反應溫度為30 ℃，最適pH值為6.0，在NaCl質量分數1%時活性最高，并且在較高NaCl質量分數下仍保持較高活性。因此，通過調節肉品加工過程的加工條件可以調控LOX活性及脂質酶促氧化的進程。