福建省2008-2017年人間布魯氏菌病流行特征及分離株MLVA分型研究

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)，是由布魯氏菌屬(Brucella，簡稱布氏菌)的細菌侵犯機體后引起的傳染-變態反應性的人獸共患傳染病。布氏菌主要存在于牛、羊、豬等家畜和野生動物中，人直接或間接接觸被感染的動物及其制品后可被感染，若治療不及時易轉為難以治愈的慢性病人。布病遍及世界約170個國家和地區，已成為全球特別是發展中國家所面臨的重要公共衛生問題之一[1]，我國每個省區的人畜中幾乎都有不同程度的存在和流行[2]，嚴重危害人類健康、危及食品安全和阻礙畜牧業經濟發展。20世紀90年代中期以來，我國布病疫情明顯回升，尤其是2000年以后，布病疫情強勢走高，報告發病例數平均每年增長10%[3]，近幾年，福建省布病病例報告數增加，發病率呈逐年增高趨勢，聚集性疫情時有發生[4]。本文分析2008-2017年福建省人間布病流行特征，并對布氏菌分離株進行基因分型，探討菌株間內在聯系，通過對布氏菌分離株進行分子流行病學研究，為制定布病預防控制策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1資料來源 2008-2017年人間布病疫情資料來自《中國疾病預防控制信息系統》中布病報告卡(已審核卡和臨床與實驗室診斷病例)；人口資料來自《中國疾病預防控制信息系統》福建省常住人口。

1.2菌株來源 40株疑似布氏菌分離自福建省2012-2018年期間布病現癥病人血液標本，布氏菌標準參考菌株羊種(16M)、豬種(1330)和牛種(544)與疫苗菌株S2和M5均由本實驗室保存。

1.3儀器與試劑 主要儀器有LabChip GX II Touch生物大分子分析儀(PerkinElmer公司)、DNA 5K/RNA/CZE LabChip芯片、CLASS II TYPEA2生物安全柜、CO2培養箱、梯度PCR儀、冷凍高速離心機、電泳儀、凝膠成像系統等；主要試劑有布氏菌培養基(BD產品)、細菌基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN產品)、EasyTaq PCR SuperMix(全式金產品)、HT DNA 5K Reagent Kit試劑盒、DL2000 DNA marker(Takara產品)等，所用試劑均在保質期內。引物合成與測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4傳統生物學鑒定 根據菌落染色、形態、生長特性和布氏菌診斷血清凝集試驗確定布氏菌，利用單項特異性A/M血清凝集試驗(玻片凝集試驗)、H2S產生試驗、CO2需求、雙層瓊脂法噬菌體(TB和BK2)裂解(RTD)試驗、染料硫堇/堿性復紅抑菌試驗等進行種/型鑒定，具體操作步驟參照文獻[5]進行。

1.5菌株DNA制備 將分離菌株轉種于布氏菌斜面培養基，37 ℃培養48 h，挑取適量對數生長期的布氏菌菌苔于300 μL無菌去離子水中混勻，80 ℃ 2 h滅活細菌后，按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取DNA， -20 ℃凍存備用。

1.6BCSP31-PCR和AMOS-PCR 根據BCSP31核苷酸序列設計的引物可以對布氏菌進行屬的鑒定；AMOS-PCR可鑒定牛種布氏菌(1、2、4型)，羊種布氏菌(1、2、3型)，豬種布氏菌(1型)以及綿羊附睪種布氏菌。引物序列、擴增體系及反應條件參考文獻[5-7]進行。

1.7MLVA-16(16位點可變數目串聯重復序列分析) 這是一個基于PCR技術的分型方法，該方法通過區分基因組上多個具有多態性串聯重復序列位點 (VNTR)的重復單元拷貝數的差異來區分菌株。16 個位點的16對引物分為2組：panel 1包括8個位點(Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce 42、Bruce43、Bruce45和Bruce55), panel 2包括panel 2A的3個位點(Bruce18、Bruce19和Bruce21)和panel 2B的5個位點(Bruce04、Bruce07、Bruce09、Bruce16和 Bruce30)。引物序列、擴增體系及反應條件均參考文獻[8-10]進行，每次擴增均以16M參考菌株作陽性對照。PCR產物嚴格按照LabChip GX II Touch生物大分子分析儀、DNA 5K/RNA/CZE LabChip芯片和HT DNA 5K Reagent Kit試劑盒操作步驟和使用說明來分析確定各位點擴增產物的大小[11]，同時結合測序結果，計算檢測位點中各VNTR的重復單元數，將16個位點串聯重復數值輸入到 http://mlva.u-psud.fr/，與數據庫進行比較，確定該菌株基因型別。獲得所有菌株的重復序列個數后，利用BioNumerics 6.6軟件對16個位點進行聚類分析。同時選取已發表文獻中其他省份的布氏菌株的MLVA-16結果進行比較。

1.8統計方法 使用SPSS 24.0統計軟件，結合描述性流行病學方法進行分析，P<0.05差異有統計學意義。根據PCR產物大小換算各位點重復單元數，結果錄入 Excel數據庫中，利用BioNumerics6.6軟件進行聚類分析，選擇平均連鎖聚類法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA),將獲得的分型與布氏菌數據庫在線比較。

2 結 果

2.1疫情概況 福建省2008-2017年共報告布病416例，無死亡；年均報告發病率0.11/10萬，發病率總體呈逐年上升趨勢(趨勢χ2=256.92，P<0.01)，圖1。

圖1 福建省2008-2017年人間布魯氏菌病發病情況Fig.1 Annual incidences of brucellosis in Fujian Province during 2008-2017

2.1.1地區分布 福建省各設區市均有病例報告，總體呈散發態勢。漳州(128例)、泉州(68例)和南平(67例)發病數居前3位，占病例報告總數的63.2%；報告發病率居前的設區市依次為漳州(0.26/10萬)、南平(0.25/10萬)和寧德(0.11/10萬)，莆田最低(0.03/10萬)。疫情累計波及全省70個縣區(80%)，各年發病縣區數分別為3、3、4、12、14、18、21、36、28和40個，呈增加趨勢(趨勢χ2=103.72，P<0.01)；以縣(區)為單位，發病數前5位依次為邵武市(51例)、龍海市(44例)、南安市(27例)、薌城區(24例)和平和縣(21例)，合計占全省病例的40.1%，報告發病率以邵武市最高(1.85/10萬)，其次為龍文區(0.68/10萬)和龍海市(0.48/10萬)。

2.1.2時間分布 人間布病全年均有發生，發病高峰為4-8月，報告發病數為228例，占全年發病數的54.8%；發病數較多的月份為5月(55例，13.2%)、4月(46例，11.1%)，其次為6月和8月，均為44例，占比均為10.6%。冬季發病較少，其中11月份報告發病數較低，為17例。

2.1.3人群分布 416例病例中，男297例，女119例，發病率男女性別比為2.50∶1，分別為 0.15/10萬和0.06/10萬，差異有統計學意義(χ2=67.50，P<0.01)。發病年齡7個月至79歲，40～64歲合計占62.7%，其中發病數以45～49歲組最多66例(15.9%)，發病率以60～64歲組最高 (0.27/10萬)。職業以農民(174例)、家務及待業(46例)和牧民(37例)為主，占比61.8%，其中農牧民為50.7%；商業服務、離退人員、工人等其他職業占比38.2%，其中學生和散居兒童為4.8%，職業不詳和其他為21.2%。

2.2傳統生物學鑒定 40株疑似布氏菌分離株在普通大氣下即可生長，呈現圓形、濕潤、稍隆起、表面光滑、無色透明的菌落形態和無色、透明、濕潤的菌苔特點；布氏菌診斷血清凝集試驗均為陽性；所有試驗結果判定參照FAO/WHO布病專家委員會第6次公報公布的布氏菌屬分類表(1985年)，分別鑒定為5株豬種3型布氏菌和35株羊種3型布氏菌，羊種菌占比87.5%。

2.3BCSP31-PCR鑒定 提取40株疑似布氏菌分離株、3株標準菌株和2株疫苗菌株核酸，用標準菌株和疫苗菌株作陽性對照，無菌水作陰性對照，進行BCSP31-PCR擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測結果顯示，所有布氏菌分離菌株和參考菌株均出現擴增目的片段長度為223 bp的特異性條帶，擴增獲得了預期片段，判定為布氏菌，而陰性對照未出現條帶，圖2。

M:DL2000 DNA Marker; 1～5：陽性對照，分別為羊種16M，牛種544，豬種1330，疫苗菌株S2和M5; 6：陰性對照; 7～46:為分離菌株圖2 福建省布魯氏菌分離株BCSP31-PCR鑒定結果Fig.2 BCSP31-PCR identification for Brucella isolates from Fujian Province

2.4AMOS-PCR鑒定結果 AMOS-PCR對40株布氏菌分離株，3株標準菌株和2株疫苗菌株核酸進行擴增，擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測結果顯示，所有陽性對照均出現特異性條帶，擴增獲得了預期片段，分別為羊種(16M和M5)731 bp、牛種(544)498 bp和豬種(1330和S2)285 bp，陰性對照未見擴增；布氏菌分離株中35株均擴增獲得731 bp特異性條帶，與羊種布氏菌(1、2、3型)擴增結果一致，判定為羊種布氏菌；其余5株布氏菌分離株均未出現條帶，豬3型布氏菌未能鑒別出，圖3。

M:DL2000 DNA Marker; 1～5：陽性對照，分別為羊種16M，牛種544，豬種1330，疫苗菌株S2和M5; 6：陰性對照; 7～46:為分離菌株圖3 福建省布魯氏菌分離株AMOS-PCR鑒定結果Fig.3 AMOS-PCR identification for Brucella isolates from Fujian Province

2.5MLVA-16分型 40株布氏菌分離株來自福建省9個設區市中的8個。所有分離株聚類成羊種菌(35株)和豬種菌(5株)2個種群，豬種菌均來自漳州地區。

panel 1用于確定布氏菌的種和地理信息。其結果顯示，35株羊種菌分屬于3種基因型：42型(1-5-3-13-2-2-3-2)29株(82.9%)，43型(1-5-3-13-3-2-3-2)4株，63型(1-5-3-13-2-3-3-2)2株，三種基因型均屬于“東地中海型”(East Mediterranean group)；panel 2A結果顯示均為基因41型(4-20-8)。5株豬種菌 panel 1顯示均為基因4型(2-3-4-11-3-1-5-2)，panel 2A顯示均為基因15型(4-19-9)。panel 2B則顯示了較高的變異性。

綜合16個位點擴增結果，MLVA-16顯示40株布氏菌包含32種基因型，羊種菌、豬種菌分別含有28種和4種基因型，其中26種基因型為單分離株，6種基因型為共享基因型，分別由2-4株布氏菌分離株共享(共14株，35.0%)。6種共享基因型中01基因型(4株)分離自漳州和廈門，03基因型(2株)分離自三明和廈門，其他05(2株)、15(2株)、26(2株)和31(2株)共享基因型均分離自同一地區，其中漳州地區分離的羊種菌和豬種菌中均有共享基因型，圖4。

同國內已發表文獻[9-10,12]中的147株布氏菌(羊種菌105株、豬種菌26株和牛種菌16株)MLVA-16分型結果進行聚類分析，福建省5株羊種菌與外省菌株存在4種共享基因型，其中3株與內蒙古地區羊種菌共享3種基因型，2株與廣東羊種菌共享1種基因型。其他部分菌株與外省菌株存在著較近的遺傳距離，主要表現在panel 2B有1-3個位點的差異，圖5。

3 討 論

目前，我國布病疫情正處于歷史上較為嚴重的時期，布病病例主要集中在北方地區，南方地區以散發病例為主，但暴發疫情仍時有發生[4,13]。福建省近幾年畜牧業快速發展，從省外引進家畜較多，地區間牲畜及其制品交易和流通日益頻繁，由于檢疫監管制度不健全和布病動物撲殺制度難以執行，導致檢疫無保障，許多未經檢疫和患病的牲畜及其制品頻繁流通于市場中，加之群眾缺乏布病防治知識，為布病的輸入和疫情高發埋下了隱患。自2008年起，福建省布病流行強度呈逐年增高態勢，疫情從局部高發地區逐漸向相鄰低發或無疫情地區快速擴散，累計波及全省70個縣區，病例呈逐年增加趨勢，并由職業人群向一般人群蔓延。福建省布病發病呈高度散發狀態的同時又呈現一定地域性，多分布于漳州和南平地區，可能與其羊、豬等家畜飼養及其制品加工業較發達有關。因此，重點控制布病疫情高發區的同時，也要做好相鄰低發區的布病防控，必要時應嚴格限制活畜從高風險地區向低風險地區流動，防止疫情的快速蔓延與擴散。

圖4 福建省布魯氏菌分離株MLVA-16聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram based on the MLVA-16 genotyping assay(UPGMA method), showing relationships of the 40 Brucella isolates from Fujian Province

圖5 福建省布氏菌分離株MLVA-16基因型聚類分析MST圖Fig.5 Clustering analysis (minimum spanning tree for categorical data) based on MLVA-16 genotype data, showing relationships between the 40 Brucella isolates from Fujian Province and 147 other strains from different regions in China

福建省布病全年均有病例報告，發病高峰期在4-8月，其季節性變化與羊種布氏菌人間發病高峰一致，與羊群產羔及流產季節密切相關[13]，結合分離菌株羊種占比高達87.5%，說明福建省流行的優勢布氏菌種為羊種布氏菌。福建省近幾年男性布病發病率高于女性，男女性別感染布病的區別可能取決于男性從事畜牧業生產及屠宰等活動較多，與病畜接觸機會較高導致，但沒有性別敏感性差異[13]。任何年齡組人群對布氏菌皆易感，發病年齡以40～64歲為主，同樣是取決于病畜接觸機會[14]，因為青壯年作為主要勞動力，與病畜接觸頻繁而導致其感染機會增高。福建省布病發病仍然以農牧民等職業人群為主，但近幾年已經呈現家務及待業、離退人員、商業服務、學生等非職業性感染增多的趨勢，說明目前布氏菌的感染因素和途徑更加復雜化，菌株毒力較強，偶然接觸即可被感染。

本研究選用的3種基于PCR技術的布氏菌分子鑒定與分型方法(BCSP31-PCR、AMOS-PCR和MLVA-16)，基本可以完成國內主要引起人感染的流行菌種(型)鑒定，可以用來彌補傳統布氏菌種型鑒定中的不足[15]。通過對40株福建省布氏菌分離株的檢測結果也與傳統分型基本一致，兩者綜合顯示福建省的布氏菌為2個種(羊種和豬種)和2個生物型(羊3型和豬3型)，其中羊種布氏菌占絕大多數(87.5%)，以羊3型為福建省當前主要流行菌型，提示福建省控制人間布病疫情應重點控制羊的布病疫情。此外，本次研究中分離的人間布氏菌株并未發現牛種等布氏菌，本省是否存在其它種布氏菌有待于今后分離更多的人/畜間布氏菌株進行驗證。

目前，國際上通用的基于16個位點的布氏菌MLVA分型方法(MLVA-16)，具有快速、操作簡單、重復性好等優點，不涉及大量活菌操作，極大地降低了實驗室感染機率，且結果轉化為字符數據類型，便于實驗室間的比較和保存，已在分子流行病學、區分基因型、種群結構和菌株間親緣進化關系等方面得到廣泛應用，可以作為傳統表型鑒定方法的補充，為布病流行病學溯源提供更多的分子生物學證據。40株布氏菌分離株分別聚類成羊種和豬種2個種群，35株羊種菌在panel 1的8個位點分別為基因42、43和63型，均屬于“東地中海型”(East Mediterranean group)，其中基因42型在省內分布廣泛，同國內其他地區研究結果一致[9]。Panel 2中的panel 2B的5個位點變異度較高，對分析菌株基因多態性和相同生物型菌株間的變異更有價值，可將35株羊種菌分為28個基因型，5株豬種菌分為4個基因型，表明福建省目前流行的布氏菌存在著豐富的基因多態性。

聚類分析結果顯示，福建省分離的部分菌株間存在共享基因型，漳州、南平、寧德和龍巖地區分離的部分菌株基因型分別一致，提示上述地區近幾年存在著布病聚集性疫情的可能，與我省近幾年報告的布病聚集性疫情事件基本一致[4]。廈門與漳州、三明地區分離的部分菌株分別出現共享基因型，提示市場中染疫動物及其制品的跨區域傳播未得到有效控制，農牧部門應加強畜間疫情監測和布病防控措施的落實。不同時間于不同地區分離得到的布氏菌基因型一致，是因為該基因型長期存在于某一地區的動物中，發生了跨區域運輸與交易引起交叉感染，還是因為購自于同一地區的患病動物及其制品引起，則需要結合當地畜間布氏菌分子流行病學進行相互驗證，這方面有待于進一步研究。同時，26個分離株表現出不同的基因型，顯示流行病學無關的散發特征，提示福建省目前布病疫情仍然以散發為主。值得強調的是，雖然羊種布氏菌為福建省乃至全國當前主要流行菌型，但作為福建省布病疫情較為嚴重的漳州地區，時常發生由豬種布氏菌引起該地區人間布病聚集性疫情[4]，可能與該地區近幾年養豬業快速發展，從事養豬、屠宰加工的布病高危人群快速增加，同周邊地區或省外牲畜交易和流動活躍等有關；并且豬種布氏菌對人致病性更普遍[10]，因此在做好羊種布病防控的同時，漳州地區亦要加強豬種布病的防控，做好病豬的撲殺補償制度，防止傳染源轉移造成疫情的蔓延。

此外，部分發病時間相近或發病地區相近的同一種型的菌株往往分別聚在一起，顯示出基因型高度相似性，說明在這一年或近幾年同一地區或相近地區流行菌株基因型相同或相近，分別存在著優勢基因型[12,16-17]。結合菌株分離時間、地區和患者發病時間等詳細流行病學資料，聚類在同一基因型別的簇中的這些菌株可能存在共同感染來源(同一群羊或同一群豬)，提示預警信息，可用于發現布病疫情暴發關聯，查找危險因素，示蹤傳播途徑，進而追溯傳染來源[17]。

既往研究證實，MLVA-16基因分型結果與流行病學資料有較好的相關性，流行病學相關的分離株顯示相同或非常相似的基因型[18-19]。MLVA-16分型在布病疫情暴發中流行病學關聯的識別和反向追蹤調查方面，可以作為一個非常實用和重要的分子基因分型工具。通過與國內其他省份布魯氏菌MLVA-16分型結果的聚類分析，顯示福建省與其他省部分菌株存在著高度同源性，如與內蒙古和廣東省菌株甚至出現MLVA-16基因型別一致的現象，其他部分菌株僅在panel 2B出現1～3個位點的差異，提示福建省可能與其他各省之間存在著長期的地區間牲畜及其制品流通，在加強從布病主要流行病區牲畜及其制品進入檢疫監管力度的同時，亦要防范周邊布病非主要流行病區染疫動物的流入，若不能加強傳染源的防控力度，勢必會造成本地疫情暴發和外來輸入性傳播的內外雙重風險的夾擊，給布病防控帶來極大的難度。

綜上所述，針對福建省布病疫情和分子流行病學特征，建議：1)農牧部門應加強畜間布病監測(包括病原學監測)，增強畜間檢疫及布病動物撲殺等措施落實，做到從源頭防控布病動物的流通擴散；2)衛生部門應加強基層醫務人員布病診療水平、醫院實驗室診斷能力和職業人群及密切接觸人群的健康教育與行為干預，做到人間布病早發現、早診斷和早治療；3)建立以政府為主導，多省市多部門協助的聯防聯控機制，定期相互通報人/畜間布病疫情；4)盡快建立適合于基層推廣應用的布病診斷和布氏菌分型新方法，并應用于日常布氏菌監測和疫區的布病防治工作中，與傳統布病防控方法相結合，做到真正意義上的早期預警和流行病學溯源，及時提示預警信息，追溯傳染來源，有助于分析布病疫情及流行趨勢，為防控策略的制定和實施提供科學依據。

利益沖突：無

引用本文格式：韓騰偉,林代華,劉菁,等.福建省2008-2017年人間布魯氏菌病流行特征及分離株MLVA分型研究[J].中國人獸共患病學報,2019,35(5):382-388.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.059