上海地區臨床分離念珠菌的耐藥性監測

慎 慧， 郭 建， 張 旻， 孔雯娜， 肖晶晶， 吳文娟， 劉 云， 陳險峰， 謝瀲滟，湯 榮， 董郭平， 李 莉， 孫 燕， 李 敏， 徐陽飏0，張靜華，黃聲雷，奚 衛，蔡金鳳，陳?？?，李 麗，秦惠宏， 舒 文， 曹文俊，王愛敏，衛穎玨， 黃衛春，張雯雁， 趙 虎，袁軼群0，沈振華，房 華

近年來臨床上免疫功能低下人群逐年增多，侵襲性真菌感染的發生率明顯上升，其中常見致病真菌包括念珠菌屬、新型隱球菌和曲霉屬感染的年發病率已經達到萬分之一以上，念珠菌感染的發生率已經升至醫院感染的第4位[1-5]。侵襲性真菌感染由于缺乏可靠有效的早期診療方法，病死率居高不下，念珠菌血癥的病死率高達40%，侵襲性曲霉感染未能及時診療的病死率高達90%以上，已經成為嚴重威脅人類健康的感染性疾病[6-8]。

隨著抗真菌藥物尤其是唑類抗真菌藥物如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等在臨床上的大量、廣泛使用，真菌耐藥現象日趨嚴重；有些真菌如克柔念珠菌等天然耐藥；真菌有高適應性特點，在體內形成生物被膜、轉變成菌絲后也會高度耐藥，耐藥性成為侵襲性真菌感染治療失敗的主要原因之一[9-11]。尤其是近年來“超級真菌” 耳念珠菌的出現，引起了全世界臨床和基礎研究的科學家及疾病防控部門的高度關注[12-13]。

為了實時、動態監測上海地區醫院侵襲性真菌感染病原菌的分離情況以及抗真菌藥物的耐藥性，2017年6月上海市衛計委成立了真菌耐藥監測工作組，由東方醫院作為組長單位，全市27所醫院（16所三甲綜合性醫院，8所三甲?？漆t院，3所二級醫院）作為成員單位。本研究對上海市真菌耐藥監測工作組2017年8月-2018年4月上海地區臨床分離念珠菌進行了分離鑒定和耐藥性監測，了解臨床分離念珠菌對常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率，引起臨床醫師對臨床分離念珠菌及抗真菌藥物合理應用的重視，為臨床有效診斷、治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集 收集2017年8月1日-2018年4月30日上海地區27所醫院臨床分離念珠菌屬菌株，剔除同一患者分離出的重復菌株。同一患者不同時間同類標本，只對初次分離菌株進行分析。所有標本來自于患者的無菌體液，包括血液、腦脊液、穿刺液及組織等以及非無菌體液如支氣管肺泡灌洗液（BALF）、膿液、引流液、導管、分泌物、透析液等。

1.1.2 試劑和儀器 沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂平皿、真菌藥敏接種肉湯、去離子水、藥敏板（YeastOne plate）、0.5 McFarland 濁度標準品、比濁儀、Sensititre AIM加樣器、SensititreVizion讀板儀、Sensititre一次性加樣頭，均為Thermo Fisher公司商 品。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）[14]進行，分離的真菌菌株接種至科瑪嘉顯色培養基或沙堡弱真菌培養基，根據生長菌落的顏色，結合VITEK 2-Compact YST卡或質譜進行初步鑒定。中心實驗室（上海市東方醫院南院檢驗科）對所有菌株均采用質譜鑒定復核，不一致者使用真菌ITS DNA序列分析確認。

1.2.2 藥敏試驗 采用比色微量稀釋法（Sensititer Yeast one，Thermo Fisher公司），每塊藥敏板都包被有適當濃度的抗真菌藥物和顯色劑。藥物包含三唑類藥物氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑，棘白菌素類藥物卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈以及5-氟胞嘧啶和兩性霉素B。藥敏板在35 ℃真菌培養箱內孵育24～25 h。24 h培養后檢查陽性對照生長微孔。如果生長對照孔呈紅色，則為試驗終點；如果生長對照孔仍然是藍色或只有輕微紫色，則再培養24 h，檢查是否有菌生長。通過配套儀器觀測表現為生長抑制的最低抗真菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。質控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌 ATCC 6258。

1.2.2 判斷標準 參照2017年美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）M60文件：酵母抗真菌藥物敏感試驗操作標準（Performance Standards for Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts）。

2 結果

2.1 菌株分布

2017年8月-2018年4月共收集上海市27所醫院臨床分離念珠菌共354株，其中4所兒童?？漆t院的臨床分離株占11.58%（41/354）。標本主要來自實體腫瘤患者（34.18%）、重癥監護患者（24.58%）、胃腸道手術患者（13.84%）。所有標本來自患者的無菌體液如血液、腦脊液、穿刺液及組織等，以及非無菌體液如BALF、膿液、引流液、導管、分泌物、透析液等。標本分布為血液47.46%（168/354）、胸腹水11.02%（39/354）、膽汁9.60%（34/354）、引流液7.63%（27/354）、BALF 6.50%（23/354）、導管5.08%（18/354）、分泌物3.11%（11/354）、穿刺液2.26%（8/354）、膿液2.26%（8/354）、透析液1.69%（6/354）、腦脊液1.41%（5/354）、組織0.56%（2/354）、關節液0.56%（2/354）和其他體液0.85%（3/354）。臨床分離念珠菌菌種標本類型分布見表1。

表1 臨床分離念珠菌菌種標本類型分布及構成比Table 1 Distribution of clinical Candida isolates in Shanghai by specimen type

所有臨床分離念珠菌菌種分布見表2。其中，腦脊液標本分離的5株念珠菌分別是2株白念珠菌、2株熱帶念珠菌和1株近平滑念珠菌；組織標本中分離的2株念珠菌分別為白念珠菌和近平滑念珠菌。

4所兒童?？漆t院的41株臨床分離念珠菌中包含近平滑念珠菌、白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和季也蒙念珠菌，分別占56.10%、24.39%、9.76%、2.44%、7.32%。本研究顯示，與綜合性醫院相比，兒童醫院的臨床分離念珠菌中近平滑念珠菌數量多于白念珠菌。

2.2 念珠菌屬對抗真菌藥物的敏感率和耐藥率

2.2.1 白念珠菌 27所醫院分離的148株白念珠菌對氟康唑的敏感率為94.20%，劑量依賴性敏感（SDD）率 4.35%，耐藥率1.45%；對伏立康唑的敏感率為95.65%，中介率2.17%，耐藥率2.17%。白念珠菌對卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈的敏感率為100%（表3）。血液標本中共分離45株白念珠菌，對氟康唑的敏感率為93.34%，SDD率4.44%，耐藥率2.22%；對伏立康唑的敏感率為91.12%，中介率6.66%，耐藥率2.22%；對卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈的敏感率為100%（表4）。兒童?？漆t院分離的10株白念珠菌對氟康唑的敏感率為90.00%，SDD率10.00%；對伏立康唑的敏感率為90.00%，中介率10.00%；對卡泊芬凈、米卡芬凈、米卡芬凈的敏感率均為100%，與綜合性醫院相比其藥物敏感率無明顯差異。

表2 臨床分離念珠菌菌種分布及構成比Table 2 Distribution of clinical Candida isolates in Shanghai by species

表3 上海市臨床分離白念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 3 Susceptibility of clinical Candida albicans isolates to antifungal agents in Shanghai

2.2.2 近平滑念珠菌 27所醫院分離的84株近平滑念珠菌對氟康唑的敏感率為98.80%，SDD 率1.2%；對伏立康唑的敏感率為98.80%，中介率1.2%。近平滑念珠菌對卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈的敏感率均為100%（表5）。4所兒童?？漆t院分離的23株近平滑念珠菌對氟康唑的敏感率為95.65%，SDD率4.35%；對伏立康唑的敏感率為95.65%，中介率4.35%；對卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈的敏感率為100%，與綜合性醫院相比其藥物敏感率無明顯差異。

表4 血液標本分離白念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 4 Antifungal susceptibility of the clinical Candida albicans strains isolated from blood in Shanghai

表5 臨床分離近平滑念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 5 Susceptibility of clinical Candida parapsilosis isolates to antifungal agents in Shanghai

2.2.3 熱帶念珠菌 27所醫院分離的55株熱帶念珠菌對氟康唑的敏感率為45.45%，SDD率12.73%，耐藥率41.82%；對伏立康唑的敏感率為47.27%，中介率12.73%，耐藥率40.00%。熱帶念珠菌對卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈的敏感率均為100%（表 6）。

2.2.4 光滑念珠菌 27所醫院分離的33株光滑念珠菌對氟康唑的SDD率93.94%，耐藥率6.06%。光滑念珠菌對阿尼芬凈、米卡芬凈的敏感率為100%，對卡泊芬凈的敏感率為96.97%、耐藥率3.03%（表7）。

由于目前CLSI尚未給出泊沙康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶對念珠菌屬的藥敏折點，所以無法判斷該藥的敏感率和耐藥率，在此僅統計了這4種藥物的MIC50和MIC90值（表3～表 7）。

3 討論

近年來侵襲性真菌感染發生率逐年上升，臨床上可用于侵襲性真菌感染的藥物品種較少，同時由于缺乏早期快速診斷技術導致了大量預防性或者經驗用藥，使得真菌耐藥日益嚴重，已經成為治療失敗的主要原因之一[9-11]。其中念珠菌是最常見的臨床致病真菌，念珠菌感染的發生率已經升至醫院感染的第四位[5，10]。

表6 臨床分離熱帶念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 6 Susceptibility of clinical Candida tropicalis strains isolated from invasive fungal infection to antifungal agents in Shanghai

表7 臨床分離光滑念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 7 Susceptibility of clinical Candida glabrata isolates to antifungal agents in Shanghai

為了掌握上海市臨床真菌感染病原學及耐藥狀況，2017年5月上海市細菌耐藥監測網更名為上海市細菌真菌耐藥監測網，增設真菌耐藥監測工作組，由同濟大學附屬東方醫院為組長單位，上海地區27所醫院為組員單位（含16所三甲綜合性醫院，8所三甲?？漆t院，3所二級醫院）。真菌耐藥監測工作組于2017年8月正式啟動工作，組長單位每月對27所成員單位臨床診斷侵襲性真菌感染病例分離菌株進行收集，并監測抗真菌藥物敏感性，為真菌感染合理診治提供依據。

2017年8月-2018年4月共收集上海市27所醫院侵襲性真菌感染臨床分離念珠菌屬共354株，血液標本分離念珠菌占第一位（47.46%），標本主要來源于實體腫瘤患者、重癥監護患者和胃腸道術后患者，表明接受侵襲性操作、屏障破壞和免疫受損者易感性高。文獻研究提示，醫院內重癥監護患者使用呼吸機和中心靜脈導管可能是侵襲性念珠菌感染的主要危險因素；腫瘤化療患者存在免疫功能低下和腸黏膜損傷，可導致腸道內共生的念珠菌跨過腸黏膜屏障，形成侵襲性感染；胃腸道手術后使得腸壁損傷，也可導致腸道內共生的念珠菌跨過腸黏膜屏障，形成侵襲性感染 [15-17]。

本研究臨床分離念珠菌中分離率最高的仍然是白念珠菌（41.81%），Xiao等[18]報道了我國2009-2014年醫院內白念珠菌在念珠菌中分離率為44.9%，說明上海地區醫院內白念珠菌分離率基本與全國整體水平一致。近年來相關文獻報道，非白念珠菌分離率有上升趨勢，應該引起臨床醫師的重視[19-21]。本研究中非白念珠菌中以近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌為主（48.59%），其余念珠菌如克柔念珠菌、擬平滑念珠菌等分離率為9.6%，總體分離率基本上也與國內外報道情況一致[2-3，18]。

白念珠菌是最常見的臨床致病真菌，與Yang等[22]報道2008-2012年上海瑞金醫院分離侵襲性白念珠菌耐藥率相比，本研究顯示上海地區臨床分離白念珠菌對氟康唑（1.45%對7%）和伏立康唑（2.17%對4.7%）的耐藥率略有下降，可能與目前棘白菌素類抗真菌藥物使用增加、唑類藥物使用量減少有關，但是耐藥率仍然略高于全國水平[18]；對于伏立康唑，白念珠菌的耐藥率基本平穩。近年來IDSA臨床指南[23]已將新型棘白菌素類藥物列入念珠菌血癥的初始用藥（強烈推薦），本研究顯示目前上海地區分離白念珠菌尚未出現耐藥株。

近年來非白念珠菌分離率有上升趨勢，本研究中發現上海地區侵襲性非白念珠菌中以近平滑念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌為主。本研究中近平滑念珠菌分離率在非白念珠菌分離率占比最高，其對唑類藥物的耐藥率低于白念珠菌，同時低于上海瑞金醫院2008-2012年唑類藥物耐藥率[22]。本研究中93.94%光滑念珠菌對氟康唑屬于SDD，僅1株光滑念珠菌對卡泊芬凈耐藥，對其他藥物的敏感性情況基本上與白念珠菌一致。值得注意的是，熱帶念珠菌對唑類藥物的耐藥率與上海瑞金醫院2008-2012年分離菌株耐藥率相比顯著上升，對氟康唑和伏立康唑的耐藥率達到40%，顯著高于Xiao等[18]在中國侵襲性真菌監測研究中的報道，需要引起臨床及檢驗科醫師的高度重 視。

綜上所述，醫院獲得性感染的重要病原真菌的發生發展是由于抗真菌藥物選擇性壓力、耐藥基因水平傳播和耐藥克隆菌株傳播共同作用的結果。不同的臨床分離念珠菌對常見抗真菌藥物的耐藥性呈現差異，了解藥物的敏感性，能夠促進臨床醫師對侵襲性念珠菌感染和抗真菌藥物合理應用的重視，為臨床有效診斷、治療侵襲性真菌病提供依據。