諸葛菜種子抗真菌蛋白的提取及其抑菌活性

張瑋瑋，袁素素，王財成，葉秀娟

(福建農林大學生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室，福建福州350002)

抗菌蛋白是植物在長期進化過程中產生的具有抗微生物活性的一類防御性蛋白[1]，是機體天然免疫系統的重要組成部分.由于抗菌蛋白具有抗菌譜廣、不易產生耐藥性、低毒性等特點，極有可能成為一類新型抗菌素或植物源殺菌劑[2].眾多研究人員已經從多種植物中分離出抗菌蛋白，并對其結構、功能和作用機理等進行了研究.例如：Ye et al[3]從甘藍(Brassica oleracea)種子中分離出一種分子質量約為30 ku的蛋白，其對落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidicola)、白色念珠菌(Candida albicans)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)均具有抑制作用，且該蛋白可以抑制鼻咽癌細胞和肝癌細胞的增殖；Lin et al[4]從芥藍(Brassica alboglabra)中純化出的抗真菌蛋白(5 907 u)能夠有效抑制尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、玉蜀黍長蠕孢(Helminthosporium maydis)、落花生球腔菌和蘋果黑腐皮殼菌(Valsa mali)的生長，還可以抑制肝癌細胞HepG2和乳腺癌細胞MCF7的增殖；Lin et al[5]還從蕓薹(Brassica campestris)中分離出抗真菌蛋白campesin(9.4 ku)，該蛋白可以抑制尖孢鐮刀菌和落花生球腔菌的生長，對HepG2和MCF癌細胞的增殖也有抑制作用.隨著研究的深入，這些天然活性產物的應用將更加廣泛.

諸葛菜(Orychophragmus violaceus)系十字花科諸葛菜屬，因農歷二月前后開藍紫色花，又稱二月藍、翠紫花[6].諸葛菜營養價值較高，其根、莖和葉均可食用[7].諸葛菜種子富含維生素B1、維生素B2、維生素C和胡蘿卜素以及鐵、鈣等礦質元素[8-11]；其含油量高達35.8%，其中，棕櫚酸、油酸和亞油酸含量較高，而亞麻酸和芥酸含量低，是非常優質的油料資源[12-14].目前，學者們已從十字花科多種植物如大白菜[15]、高菜[16]等中分離出抗真菌蛋白，但是有關諸葛菜種子中的抗真菌蛋白還未見報道.因此，本研究以諸葛菜種子為試驗材料，分離純化其抗真菌蛋白，并測定該蛋白的抑菌活性和穩定性，為促進諸葛菜抗真菌蛋白的應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諸葛菜種子：購買于江蘇省宿遷市四季青種業有限公司.

15種供試植物病原真菌：尖孢鐮刀菌、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、芭樂炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、長柄鏈格孢菌(Alternaria longipes)、煙草炭疽病菌(Colletotrichum micotianae)、玉蜀黍長蠕孢、小白菜炭疽(Colletotrichum higginsianum)、落花生球腔菌、突臍蠕孢菌(Exserohilum turcicum)、茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、蘋果黑腐皮殼菌、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsis microspora)均由福建農林大學生物農藥與化學生物學教育部重點實驗室提供.

儀器：Centrifuge 5860R高速冷凍離心機(Eppendorf公司)，LGJ-18S冷凍干燥機(上海松源華興科技發展有限公司)，AKTA pure快速蛋白純化系統(瑞典GE公司)，SPX-250智能恒溫培養箱(寧波賽福實驗儀器廠).

1.2 抗真菌蛋白的分離、純化

取150 g諸葛菜種子，加入20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液(pH 4.6)800 mL，經豆漿機粉碎后置于4℃勻漿浸提12 h，離心(8 000 r·min-1，30 min)后取上清液備用.將上清液上樣于SP-Sepharose陽離子交換層析柱(5.0 cm×20 cm)，依次用含0.2、0.5和1.0 mol·L-1NaCl的20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液進行梯度洗脫，在280 nm波長下檢測洗出液的光密度.將各組分收集，以尖孢鐮刀菌為指示菌檢測各組分抑菌活性.

將有活性的組分透析，冷凍干燥后進一步用Mono STM5/50 GL強陽離子交換柱分離，該柱預先用20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液平衡，用0～1.0 mol·L-1NaCl梯度洗脫，收集各洗脫峰，以尖孢鐮刀菌為指示菌檢測各洗脫峰抑菌活性.

將有活性的組分透析并冷凍干燥，用20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液溶解后上樣于SuperdexTMPeptide 10/300 GL凝膠層析柱，收集各洗脫峰，以尖孢鐮刀菌為指示菌檢測各洗脫峰抑菌活性，并收集活性組分，透析并冷凍干燥.

1.3 蛋白分子質量測定

Tricine-SDS-PAGE電泳方法參考文獻[3]，分離膠濃度16.5%，夾層膠濃度10%，濃縮膠濃度4%.初始電壓為30 V，電泳1 h后調至80 V，再繼續電泳2.5 h.電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250染色2 h，再用脫色液(10%甲醇和10%乙酸)進行脫色.

1.4 蛋白質譜分析

將電泳檢測為單一條帶的樣品經胰蛋白酶酶解后，用LCMSMS(nanoLC-QE)進行質譜分析，通過MASCOT等質譜匹配軟件分析LCMSMS數據，通過UniProtKB數據庫檢索、比對、鑒定分離得到的蛋白質.質譜分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成.

1.5 蛋白的抗真菌活性檢測

用紙片擴散法[17]進行測定.將待測的植物病原真菌接種于PDA培養基上，28℃恒溫培養，待菌落生長至圓面直徑為3.0～3.5 cm時，將滅菌的圓濾紙片放在距離菌絲邊緣0.5 cm處，各取15 μL蛋白樣品和對照(PBS緩沖液，pH 7.4)加在濾紙片上，28℃恒溫培養至菌落生長到濾紙片邊緣時，觀察有無抑菌活性.

1.6 蛋白對尖孢鐮刀菌生長半抑制濃度(IC50)的測定

采用瓊脂平板稀釋法[17]進行測定.將蛋白樣品用PBS緩沖液配制成一系列濃度，并經0.22 μm濾頭過濾除菌.加熱融化0.7%PDA培養基，待冷卻至40～50℃時，取0.5 mL蛋白溶液(對照組為0.5 mL PBS緩沖液)與1.5 mL培養基于培養皿(30 mm×15 mm)中混勻，用打孔器截取相同大小真菌菌塊，置于培養皿中心，封口并轉移至28℃恒溫培養，直至對照組菌落生長至培養皿邊緣.用十字交叉法測量真菌菌落的生長直徑，并計算該蛋白對尖孢鐮刀菌生長的抑菌率，每組3個重復.運用SPSS軟件對數據進行Probit回歸分析，計算IC50.

1.7 蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發IC50的測定

1.7.1 孢子制備 將尖孢鐮刀菌接種于PDA培養基上，28℃黑暗條件下恒溫培養7～15 d，取5 mL無菌水加入上述培養皿中，用涂布器在真菌表面來回刮動，濾除菌絲得到孢子懸液.稀釋孢子懸液至濃度為1×106～1×107CFU·mL-1，取等體積孢子懸液與0.05%葡萄糖溶液混合備用.

1.7.2 孢子萌發抑制率的測定 用凹玻片法[18-19]進行測定.將蛋白樣品用PBS緩沖液配制成一系列濃度，并經0.22 μm濾頭過濾除菌.取10 μL孢子懸浮液(對照組為PBS緩沖液)與10 μL蛋白溶液混勻，加在凹玻片中央，置于含有兩層浸濕的無菌濾紙片的培養皿(90 mm×15 mm)中，28℃恒溫保濕培養至對照組孢子萌發率達到90%以上時，將各培養皿放入4℃冰箱中.6 h后用光學顯微鏡觀察并記錄孢子萌發數，每組至少觀察100個孢子，每組3個重復，計算孢子萌發抑制率.運用SPSS軟件對數據進行Probit回歸分析，計算IC50.

1.8 蛋白的穩定性檢測

1.8.1 熱穩定性 取5個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中4管分別在40、60、80、100℃條件下水浴15 min(待冷卻至室溫時進行試驗)，1管未處理作為陽性對照，另取1個離心管加入PBS緩沖液0.1 mL作為陰性對照.以尖孢鐮刀菌作為指示菌，采用紙片擴散法進行抑菌試驗，每組設3個重復.

1.8.2 pH穩定性 取7個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中6管分別加入調配好的pH值為1、3、5、10、12、14的PBS緩沖液0.1 mL，1管未處理作為陽性對照，另取1個離心管加入PBS緩沖液0.1 mL作為陰性對照，室溫放置1 h.抑菌試驗方法同1.8.1.

1.8.3 有機溶劑穩定性 取6個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中5管分別加入用PBS緩沖液配制的15%(v/v)甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、丙酮溶液0.1 mL，1管未處理作為陽性對照，另取5個離心管分別加入15%甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、丙酮0.1 mL作為陰性對照，室溫放置1 h.抑菌試驗方法同1.8.1.

1.8.4 金屬離子穩定性 用 PBS 緩沖液分別配制 50、100、150、200、250 mmol·L-1的 Mg2＋、K＋、Mn2＋、Ca2＋溶液.取6個1.5 mL離心管，分別加入抗真菌蛋白(用PBS緩沖液溶解，pH 7.4)0.1 mL，其中5管分別加入50、100、150、200、250 mmol·L-1Mg2＋溶液 0.1 mL，1 管未處理作為陽性對照，以 250 mmol·L-1Mg2＋溶液作為陰性對照，室溫放置1 h.K＋、Mn2＋、Ca2＋溶液按照同樣的方法進行處理.抑菌試驗方法同1.8.1.

1.9 數據處理

用Excel和SPSS 17.0軟件對數據進行分析處理.

2 結果與分析

2.1 抗真菌蛋白的分離、純化

諸葛菜種子蛋白上清液經SP-Sepharose陽離子交換柱分離后，得到4個洗脫組分a、b、c、d(圖1A)；以尖孢鐮刀菌為指示菌，用濾紙片法測得b組分具有抗真菌活性(圖1B)，所以將b組分進一步純化.b組分經Mono STM5/50 GL強陽離子交換柱分離后，得到5個洗脫峰e、f、g、h、i(圖1C)；抑菌活性檢測結果顯示g洗脫峰具有抗真菌活性(圖1D)，所以選擇g組分進一步純化.將g組分上樣于SuperdexTMPeptide 10/300 GL凝膠層析柱進一步分離，得到j、k、l、m共4個洗脫峰(圖1E)；抑菌活性檢測結果表明l洗脫峰具有抗真菌活性(圖1F).

圖1 諸葛菜種子抗真菌蛋白的分離層析及各組分活性檢測結果Fig.1 Column chromatography and activity detection of the antifungal protein from O.violaceus seeds

Tricine-SDS-PAGE電泳結果(圖2)表明，諸葛菜種子抗真菌蛋白經過3步分離純化后，Ⅰ組分蛋白呈單一條帶，說明已達到較高純度，其相對分子質量約為10 ku，將該蛋白命名為Zp.

2.2 質譜分析結果

將Tricine-SDS-PAGE電泳得到的單一條帶進行質譜分析，在UniProtKB數據庫中檢索，結果如表1所示.經蛋白相似度和序列比對發現，Zp蛋白可能是諸葛菜種子中的一種防御素蛋白(defensin)，在UniProtKB數據庫中的序列號為C9WGT1，相對分子質量為8 737.17 u，這與電泳得出的Zp蛋白分子質量較為接近.

圖2 諸葛菜種子抗真菌蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳結果Fig.2 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the antifungal protein from O.violaceus seeds

表1 Zp蛋白的質譜鑒定與UniProtKB數據庫檢索結果Table 1 Mass spectrometry and database retrieva(UniProtKB)of Zp protein

2.3 Zp蛋白的抗真菌活性

Zp蛋白的抗真菌效果如圖3所示，其對稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、突臍蠕孢菌、煙草炭疽病菌、蘋果黑腐皮殼菌、芭樂炭疽病菌、小白菜炭疽、玉蜀黍長蠕孢、落花生球腔菌、小孢擬盤多毛孢和尖孢鐮刀菌共11種植物病原真菌均具有抑制作用，而對茄病鐮刀菌、辣椒疫霉、長柄鏈格孢菌和禾谷鐮刀菌等4種真菌沒有明顯的抑制作用.由此可知，諸葛菜種子抗真菌蛋白具有一定的廣譜性.

圖3 Zp蛋白的抗真菌效果Fig.3 Antifungal effects of the Zp protein from O.violaceus seeds

2.4 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的IC50

Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的抑制效果如圖4A所示.隨著Zp蛋白濃度的增大，對尖孢鐮刀菌生長的抑制率逐漸升高，當Zp蛋白濃度為142.5 μg·mL-1時，對尖孢鐮刀菌的抑制率超過60%(圖4B).Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長抑制的Probit回歸方程：Probit(p)＝-1.530＋0.882x.由此得出Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的 IC50為 54.36 μg·mL-1.

圖4 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌生長的抑制效果Fig.4 Inhibtory effects of Zp protein on the growth of F.oxysporum

2.5 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發的IC50

Zp蛋白可以抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發：與對照組相比，處理組孢子萌發數顯著減少，且萌發的牙管較短，有的孢子形態膨大加粗，甚至出現畸形(圖5A).隨著Zp蛋白濃度增大，對尖孢鐮刀菌孢子萌發的抑制率逐漸升高，當蛋白濃度為18.85 μg·mL-1時，孢子萌發抑制率達到60%(圖5B).Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發抑制的Probit回歸方程：Probit(p)＝-1.449＋1.204x.由此得出Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發的 IC50為 15.97 μg·mL-1.

2.6 Zp蛋白的穩定性

從圖6A可看出，Zp蛋白在40、60、80、100℃水浴處理15 min后，對尖孢鐮刀菌的抑制活性基本保持不變，表明該蛋白的熱穩定性良好.由圖6B可知，Zp蛋白在經不同pH值的溶液處理后，對尖孢鐮刀菌仍有較強的抑制作用，說明該蛋白的耐酸堿性較強.

圖5 Zp蛋白對尖孢鐮刀菌孢子萌發的抑制效果Fig.5 Inhibtory effects of Zp protein on the germination of F.oxysporum spores

圖6 Zp蛋白的穩定性Fig.6 Stability of Zp protein

由圖6C、6D可知，經15%甲醇、乙醇、異丙醇、乙醚、丙酮溶液處理過的Zp蛋白能夠明顯抑制尖孢鐮刀菌的生長，而單獨的相應有機溶劑對尖孢鐮刀菌生長并沒有抑制作用，由此說明該蛋白對有機溶劑具有一定的耐受性.由圖 6E、6F、6G、6H 可知，不含 Zp 蛋白的 250 mmol·L-1Ca2＋、Mg2＋、Mn2＋、K＋溶液對尖孢鐮刀菌生長沒有抑制作用，而含有該蛋白的不同濃度(50、100、150、200、250 mmol·L-1)金屬離子溶液對尖孢鐮刀菌生長具有明顯的抑制作用，說明Zp蛋白在強陽離子溶液中活性穩定.

3 討論與結論

本研究從諸葛菜種子中分離出一種分子質量約為10 ku的抗真菌蛋白Zp.Zp蛋白對多種植物病原真菌均具有抑制作用，其中對尖孢鐮刀菌生長的IC50為54.36 μg·mL-1，對其孢子萌發的IC50為15.97 μg·mL-1.抗真菌蛋白存在于十字花科的多種植物種子中，且這些蛋白對多種植物病原真菌具有抑制活性.例如：油菜(Brassica napus)種子中分離出的抗真菌蛋白(9 412 u)對尖孢鐮刀菌和落花生球腔菌的IC50分別為78.12和42.35 μg·mL-1[20]；甘藍種子中純化出分子質量為30 ku的抗真菌蛋白，對落花生球腔菌的IC50為150 μg·mL-1[3]；芥藍種子中純化出分子質量為5 907 u的抗真菌蛋白，對尖孢鐮刀菌、玉蜀黍長蠕孢、落花生球腔菌和蘋果黑腐皮殼菌的IC50分別為25.40、12.40、14.18和0.89 μg·mL-1[4].由此可知，Zp蛋白的抗真菌活性較強.經質譜鑒定，Zp蛋白可能是諸葛菜種子中的一種防御素蛋白.Chan et al[21]已經從褐色蕓豆(Phaseolus vulgaris)的種子中分離出一種防御素類蛋白，分子質量為5.4 ku，該蛋白也具有抗真菌活性.防御素類蛋白是植物抗菌蛋白中數目最多的一個種類且具有廣譜的抗菌活性[22].通過對Zp蛋白的抑菌活性進行檢測可知，其對尖孢鐮刀菌等11種真菌都有較強的抑制活性，表明該蛋白具有抑菌廣譜性.防御素類蛋白還具有典型的三維穩定結構[23].檢測可知，Zp蛋白具有良好的耐熱、耐酸堿性；已有研究發現，油菜種子抗菌蛋白和芥藍種子抗菌蛋白也具有熱穩定性和強酸強堿穩定性[4，24-25].Zp蛋白對有機溶劑和金屬離子也具有一定的耐受能力；Terras et al[26]研究表明，蘿卜(Raphanus sativus)種子Rs-AFP1和Rs-AFP2抗菌蛋白在K＋溶液(50 mmol·L-1)中具有抑菌活性，且抑菌活性穩定.油菜、芥藍、蘿卜以及諸葛菜都屬十字花科植物，說明十字花科多種植物種子中分離出的抗真菌蛋白具有一定的共性.

綜上所述，Zp蛋白抑菌譜廣，抑菌活性穩定，具有潛在的應用價值.但有關諸葛菜種子抗真菌蛋白抑制植物病原真菌生長的具體作用機理還有待研究.