紫化茶樹UDP-糖基轉移酶啟動子的克隆及其生物信息學分析

唐秀華， 陳志丹， 陳祖枝， 林子琪， 曹士先， 孫威江，， 謝 鳳，3，4

(1.福建農林大學園藝學院，福建 福州350002；2.福建農林大學安溪茶學院，福建 泉州362400；3.福建省茶產業工程技術研究中心，福建福州350002；4.福建茶產業技術開發基地，福建福州350002；5.福安市農業局，福建福安355000；6.武夷星茶業有限公司，福建 武夷山354300)

紫化茶樹是一種特色茶樹資源，該群體種的芽葉呈紫色或紅紫色，其紫化程度與芽葉中的花青素含量緊密相關[1-3].花青素的生物合成涉及到多種酶，糖基轉移酶是其中一個關鍵酶.研究表明，糖基轉移酶的活性在一定范圍內隨著花色素苷的合成而提高，抑制糖基轉移酶活性對花青素苷的影響比抑制其他酶更明顯[4].UDP-糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferases，UDPG)廣泛存在于植物中，是糖苷鍵合成的關鍵酶，屬于GT超基因家族，其作用是參與糖基化反應，即催化指定的活化糖基從特定供體轉移到特定受體上[5]，該反應參與多種化合物的生物合成，包括參與花青素碳骨架的修飾.在花青素的合成中，糖基轉移酶決定糖基化的位置，多數花青素的糖基化是通過類黃酮糖基轉移酶實現的.作為類黃酮代謝途徑中的一個分支途徑，花青素的合成途徑可分為3個階段，在第3個階段中，類黃酮糖基轉移酶將無色的二氫黃酮醇轉化成有色的花青素，同時增強花青素的化學穩定性、水溶性[6].

啟動子是一段能決定基因轉錄起始的核苷酸序列，其與轉錄因子之間的相互作用調節和控制了基因的特異性表達，基因轉錄起始點常常位于5′端UTR的核苷酸序列上游-20～-220 bp區域內[7-9].根據植物基因的表達方式，基因啟動子通常分為3種類型，即組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子.近年來，通過克隆研究啟動子，在減少環境脅迫、誘導基因高效表達等方面有了很大進展[10].深入研究啟動子的結構、作用功能對于了解生物反應中信號傳遞途徑和基因調控方式，加深對植物的生長調控機制、提高植物生長質量的探尋十分有幫助，如Pellegrineschi et al[11]用脅迫誘導型啟動子rd29A構建載體進行DREB1A/CBF3的表達，大大降低了干旱脅迫對小麥轉基因的調控作用.因此，啟動子克隆的研究在植物改良基因工程中具有重要意義.目前對糖基轉移酶全長cDNA克隆的研究較多，但對糖基轉移酶啟動子克隆的研究較少，張建軍等[12]通過克隆分析擬南芥糖基轉移酶基因UGT71C5啟動子，發現該啟動子是受光效應脅迫的誘導型啟動子.目前，在茶樹中尚未見對糖基轉移酶啟動子克隆的研究，因此，本試驗選取紫化茶樹武夷奇種C18葉片，采用染色體步移技術，獲得了UDPG啟動子基因序列，并對其生物信息學進行分析，有助于探尋糖基轉移酶的表達及其對花青素合成的影響，為培育紫化茶樹此類特殊種質資源提供依據，同時為UDPG基因功能的研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試紫化茶樹武夷奇種C18(圖1)由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供.選取茶樹第一葉位的葉片，用液氮迅速處理后，置冰箱(-80℃)中保存備用.

主要試劑有Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit(Biospin公司)、TaKaRa Genome Walking Kit(TaKaRa公司)、Gel Extraction Kit(OMEGA 公司)、pMD19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa公司)、大腸桿菌JM109感受態細胞(TaKaRa公司).

圖1 武夷奇種C18Fig.1 Wuyiqizhong C18

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 按照Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒說明書的方法提取基因組DNA.

1.2.2 引物設計 根據在GenBank上已登錄的CsUDPG基因(登錄號為KR902748)，按照TaKaRa Genome Walking Kit試劑盒說明書要求的引物設計原則，使用DNAMAN軟件，分別設計3條特異性引物SP1、SP2、SP3(表1).引物合成由北京六合華大基因科技有限公司完成.

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3 茶樹UDPG基因啟動子的克隆 采用特異性引物SP1、SP2、SP3及Genome Walking Kit試劑盒中的兼并引物AP3進行3次熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)擴增反應[13-15].經1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得特異性目的條帶，進行切膠回收，連接至pMD19-T載體，轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞，于培養箱(37℃)中過夜培養，進行菌落PCR鑒定，獲得的陽性克隆菌液送至北京六合華大基因科技有限公司測序.

1.2.4 茶樹UDPG基因啟動子的生物信息學分析 采用植物順式作用調控元件數據庫(Plant CARE)及植物DNA順式作用調控元數據庫(PLACE)[16]分析預測啟動子序列順式作用元件的種類、所在位置和生物學作用.通過BDGP在線軟件預測可能分布的核心啟動子區域及轉錄起始位點[17].

2 結果與分析

2.1 茶樹基因組DNA的提取及檢測

根據 Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒說明書的方法獲得紫化茶樹武夷奇種C18的基因組DNA(圖2).選取條帶清晰完整且亮度較大的2號樣品為試驗樣品，利用紫外分光光度計檢測其含量為476.7 ng·μL-1，D260nm/D280nm為 1.88，D260nm/D230nm為1.86，均滿足試驗要求，可作為后期茶樹UDPG基因啟動子克隆的模板.

2.2 茶樹UDPG基因啟動子的克隆

以武夷奇種C18的2號DNA樣品為模板，將特異性引物 SP1、SP2、SP3分別與兼并性 AP3進行 3輪TAIL-PCR擴增反應，獲得近似1 000 bp大小的目的片段(圖3)，片段大小與預期結果相符.將該片段進行膠回收、克隆及測序.測序結果表明，克隆獲得的片段實際大小為1 229 bp(圖4)，該基因的5′端上游序列與已知的CsUDPG基因序列在327 bp處重疊(圖4中的灰色部分)，則上游啟動子序列大小為902 bp.采用BDGP在線軟件進行轉錄起始位點的預測分析[18].結果表明，茶樹UDPG基因的啟動子存在2處核心啟動子區域，分別位于-778～-728、-373～-323 bp處，分值分別為0.83、0.88，可能的轉錄起始位點分別為T、A.由于0.88＞0.83，推測該基因真正的核心啟動子區域很可能位于-373～-323 bp處，位于第-371 bp處的A(圖4中的黃色標志處)則為轉錄起始位點.

圖2 武夷奇種C18 DNA的電泳結果Fig.2 DNA electrophoresis from Wuyiqizhong C18

圖3 茶樹UDPG基因啟動子PCR擴增結果Fig.3 PCR products of UDPG gene promoter

2.3 茶樹UDPG基因啟動子順式作用元件的預測結果

采用植物順式作用調控元件數據庫和植物DNA順式作用調控元件數據庫[19]進行順式作用元件預測分析.圖5和表2顯示，茶樹UDPG基因啟動子區域含有大量的核心啟動子元件，如CAAT-box、TATA-box；除此之外還有多種順式作用元件，如豐富的涉及光響應的BOX4、CATT-motif、GA-motif、GATA-motif、GT1-motif、TCT-motif，涉及高轉錄水平的5UTR Py-rich stretch，與分生組織表達相關的CAT-box，涉及胚乳表達的GCN4-motif、Skn-1-motif，涉及防御和應激反應的TC-rich repeats，涉及水楊酸響應的TCA-element，參與特異性表達的as-2-box，參與晝夜控制的circadian.以上分析表明，茶樹UDPG基因啟動子很可能與組織特異性表達、外界光照條件和茶樹體內水楊酸合成有關，這些因素都可能影響調控UDPG基因的表達.

3 討論

3.1 茶樹UDPG基因啟動子克隆方法的選擇

本試驗采用染色體步移技術中的熱不對稱交錯PCR方法克隆了紫化茶樹武夷奇種C18UDPG基因起始密碼子上游902 bp的啟動子區域序列.目前，隨著啟動子研究的發展，啟動子克隆的方法越來越多，但其適用性以及優缺點都不同.熱不對稱交錯PCR適用于5′端序列或全序列已知的基因啟動子克隆，雖然需較多引物組合，反應條件要求比較細致精密，但其簡單快速、高效靈敏、特異性高、不涉及連接反應，能夠快速分離到目標序列.與熱不對稱交錯PCR相比，反向PCR的環化反應難以控制，容易導致非特異性擴增，若限制性內切酶選取不當，容易導致試驗失??；鍋柄PCR的過程較復雜，難以控制；Y型接頭擴增法成本較高，且限制性內切酶的篩選過程繁瑣[13，16-18].因此，熱不對稱交錯PCR對于本試驗的適用性最好.

圖4 茶樹UDPG基因啟動子的克隆結果Fig.4 Cloning product of UDPG gene promoter

圖5 茶樹UDPG基因啟動子序列及關鍵元件Fig.5 Promoter sequences of UDPG gene and its key elements

表2 啟動子順式作用元件Table 2 Cis-acting regulatory elements of promoter

3.2 茶樹UDPG基因啟動子的調控預測

糖基轉移酶廣泛存在于植物體內，其含量大多比動物體多，因為植物生長會產生多種次生代謝產物，而糖基轉移酶直接參與修飾植物許多次生代謝產物的合成或降解，在細胞穩態方面起到了重要作用，因此對UDPG基因的研究具有重要意義[18].目前，相關研究證實了糖基轉移酶在植物中的活性及其生物學功能[19-24]，但其在茶樹中的功能還需要進一步探索.本試驗通過軟件預測分析了茶樹UDPG基因的啟動子結構及功能元件，明確了各順式作用元件的位置及特性.

啟動子中存在著多種順式作用元件，大致分為以下4種類型：核心啟動子元件、上游啟動子元件、遠端上游元件、特殊啟動子元件.其中，特殊啟動子元件在植物逆境脅迫誘導基因的表達中起關鍵作用[25].本試驗結果表明，茶樹UDPG基因的啟動子序列具有關鍵典型的核心啟動子元件，有22個TATA-box和21個CAAT-box.CAAT-box對于轉錄起始的頻率起到一定的影響作用，可增強啟動子的強度；TATA-box存在于多種真核生物啟動子上，具有介導基因轉錄的作用.研究顯示，含有TATA-box的基因對轉錄調控更加敏感[26].此外，茶樹UDPG基因的啟動子還包含其他多個特殊啟動子成分，如多個光響應元件(GT1-motif、GATA-motif)、水楊酸響應元件[27]、胚乳表達相關元件(GCN4-motif、Skn-1-motif)[28].其中，調控光響應的元件最多，約占1/3，其他順式元件占比相近.張建軍等[12]對擬南芥的糖基轉移酶UGT71C5啟動子進行了克隆并構建了表達載體，發現該啟動子受光照誘導啟動表達.可推測茶樹UDPG基因啟動子可能為誘導型啟動子，參與了逆境脅迫下光信號的誘導.以全光照為對照，進一步探尋不同遮陰條件下茶樹UDPG基因受光響應的表達調控機制，為優化UDPG基因的表達條件、選育紫化茶樹優良種質資源提供依據.