茉莉花MVD基因及其啟動子的克隆與表達

陳 笛，王鵬杰，鄭玉成，林 浥，鄭知臨，陳桂信，葉乃興

(福建農林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室，福建福州350002)

茉莉花[Jasminum sambac(L.)Ait]為木犀科多年生常綠灌木，既是茶用、香料植物也是藥用植物[1-2].茉莉花植株各組織部位的化學成分主要有揮發油類成分及脂肪類、糖苷類、黃酮類、萜類化合物等，均有藥用價值，其中，萜類化合物在茉莉花揮發油中廣泛存在，在根和葉中也可檢測到[3-4].在植物中，萜類化合物是通過質體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途徑和胞質中的甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑合成，而甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(mevalonate pyrophosphate decarboxylase，在已報道的文獻中簡寫為MDC、MDD、MVD、MPD或DPMDC，本文簡寫為MVD)為MVA途徑上游限速酶中的最后一個酶，能催化異戊烯基焦磷酸的生成，是一種ATP和Mg2＋的依賴酶，且屬于GHMP激酶超家族[5].目前，MVD基因已從多種植物中分離出來.在靈芝(Ganoderma lucidum)中，其MVD基因的表達與三萜化合物的含量呈正相關，并受外源茉莉酸甲酯的誘導，且MVD基因過量表達會顯著增加靈芝中三萜化合物的含量[6].金釵石斛(Dendrobium nobile)為一種名貴藥材，其MVD基因的表達受到菌根真菌的影響，且莖中MVD基因的表達量于接菌后期顯著高于對照[7].張曉東等[8]從滇龍膽(Gentiana rigescens)中克隆出MVD基因，并進行原核表達和組織特異性表達分析，結果顯示其主要在根中大量表達.對MVD基因啟動子的克隆和分析發現，其啟動子序列含有大量光響應元件，故推測光照是調控其表達的重要因素[9].研究還表明，MVD基因的表達具有組織特異性[10-11]，并被生物和非生物因素誘導[5，12].

目前，對茉莉花的研究主要集中在茉莉花開放過程中香氣物質含量的變化及一些香氣合成相關酶基因的克隆與表達分析[13-14]，而對其他組織部位和JsMVD基因的研究尚未見報道.本試驗根據茉莉花花瓣轉錄組中的JsMVD基因序列設計上下游特異引物，采用RT-PCR技術從茉莉花中擴增出JsMVD基因，并進行序列分析和啟動子克隆分析；采用實時熒光定量PCR技術檢測JsMVD基因在茉莉花植株不同組織及不同激素處理下的表達量，旨在為進一步有效調控茉莉花香氣中萜類物質的合成及茉莉花釋香時間和強度的調控提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以雙瓣茉莉花為供試材料.

1.1.2 試劑 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自百泰克生物技術(北京)有限公司；Easyscript Onestep gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒和Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒購自全式金生物有限公司；Genome Walking kit試劑盒購自TaKaRa公司.

1.2 試驗設計

于2018年8月選取成熟茉莉花花苞掛牌標記，分別用100 mg·L-1IAA、GA和ABA噴灑茉莉花苞，處理時間分別為0、2、4、6、9和12 h，并以清水(H2O)噴灑茉莉花苞作為對照.摘取上述4種處理茉莉花的根、莖、葉、花蕾及成熟花，采集3次生物學重復的樣本，液氮速凍后保存在冰箱(-80℃)中.

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書的方法提取茉莉花植株不同組織的總RNA及不同激素處理下花朵的總RNA，對RNA進行濃度和完整性等質量檢驗.參照Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒說明書的方法合成cDNA用于RT-PCR和實時熒光定量PCR檢測.

1.4 JsMVD基因的克隆

在前期茉莉花轉錄組測序的數據庫中，根據序列注釋的信息，從中篩選出相關的MVD基因編碼的EST序列，將大小超過1 000 bp的片段采用NCBI Blast比對，選擇具有完整開放閱讀框(open read frame，ORF)的MVD基因序列，并根據此序列在 ORF兩端設計全長序列擴增引物(上游引物：AAATGGCAGAAGAGAACGGG，下游引物：TCGCCCTCTTCACTTGGGAA)，進行RT-PCR擴增，驗證全長序列的準確性.RT-PCR 擴增體系：2.5 μL 10×TransTaq HiFi BufferⅡ、2 μL dNTPs、 0.5 μL 引物、0.2 μL HiFi Polymerase、1 μL 模板，用 ddH2O 補至25 μL.擴增程序：95 ℃預變性 5 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；最后于72℃延伸10 min.將RT-PCR擴增產物進行回收，并參照姚雪倩等[15]的方法進行連接轉化并挑取陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司測序.

1.5 JsMVD基因啟動子的分離

根據所得序列，利用Primer Premier 5.0軟件從起始密碼子ATG下游500 bp內設計3條巢式特異引物[特異引物1(SP1)：AGGCAAAACCAGCAGCAGATGAAG，特異引物2(SP2)：TGACGGCGACAGAAGTGGTAGT，特異引物3(SP3)：TTTTCGTCCCTCTTACCCCAATAC]，引物方向為需要擴增的未知方向，且SP2的位置應設計在SP1的內側，SP3位于SP2的內側.以提取的茉莉花花瓣的基因組DNA為模板，依據Genome Walking kit試劑盒說明書程序與試劑盒中的隨機AP引物進行3輪熱不對稱PCR擴增.

1.6 JsMVD生物信息學分析

通過NCBI Blast在線查找所得cDNA全長序列ORF并進行同源性分析，用DNAMAN軟件進行氨基酸多序列比對，用MEGA7.0軟件構建系統進化樹；用ProtParam、SignalP4.1、WOLF PSOR和Inter ProScan等在線軟件分別對JsMVD保守區所編碼的蛋白質進行理化性質、信號肽、亞細胞定位和結構功能域分析；用SOPME軟件預測基因編碼蛋白質的二級結構；通過PlantCare網站在線進行啟動子順式作用元件預測分析.

1.7 JsMVD基因實時熒光定量PCR檢測

以茉莉花植株不同組織和不同激素處理的花朵的cDNA為模板，根據JsMVD基因全長序列用Primer Premier 5軟件設計實時熒光定量PCR擴增引物(上游引物：ATAGCAAGGCAAGGTTCAGG，下游引物：GAGGTCATCCCAATGTTTCT)，以茉莉花Actin為內參基因，按照Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒說明書的方法進行實時熒光定量PCR擴增，試驗數據設置3個生物學重復.數據通過Excel軟件用2-ΔΔCt法進行定量分析，用SPSS軟件在不同顯著水平(P＜0.01，P＜0.05)上進行統計分析.

2 結果與分析

2.1 JsMVD基因的克隆及序列分析

以茉莉花花瓣cDNA為模板，經RT-PCR擴增出一條長度約為1 500 bp的單一目的條帶(圖1)，與預期目標相符.測序拼接后顯示MVD基因具有完整的ORF.Blast比對結果表明，MVD基因序列編碼完整的MVD蛋白，與其他植物MVD氨基酸序列的相似度極高，因此確定MVD基因為JsMVD基因.將JsMVD基因序列提交至Gen-Bank，獲得的登錄號為MH311041.1.

圖1 茉莉花JsMVD基因PCR的擴增結果Fig.1 PCR amplification of JsMVD gene

2.2 JsMVD生物信息學分析

測序所獲得的MVD基因全長序列的長度為1 500 bp，其編碼的JsMVD蛋白含有422個氨基酸，蛋白分子式為C2057H3271N573O627S19，分子質量為46.7 ku，理論等電點為6.57，不穩定系數為39.71，親水性為-0.296，故推測該JsMVD蛋白為親水穩定性蛋白.信號肽經SignalP4.1軟件預測顯示，JsMVD蛋白的N端存在信號肽的可能性較低，且亞細胞定位預測結果顯示其位于細胞質中，故推測JsMVD基因在細胞質內合成后直接催化甲羥戊酸5-焦磷酸(MVAPP)在C5處脫羧，合成萜類化合物共同前體物質——異戊烯焦磷酸(IPP).

所得序列經Blast比對顯示，JsMVD編碼的氨基酸序列與野生油橄欖(Olea europaeavar.sylvestris，XP＿022889972.1)、牽?；?Ipomoea nil， XP＿019191905.1)、長春花(Catharanthus roseus， ADR65112.1)和葡萄(Vitis vinifera，XP＿002266399.1)等植物有較高的相似性，相似系數分別達到88%、86%、85%和84%.結構域經Inter ProScan軟件分析顯示，JsMVD蛋白含有位于第116～174氨基酸處的GHMP激酶N-端保守區域和第203～420氨基酸處的GHMP激酶C-端保守區域.JsMVD氨基酸序列含有9個與ATP結合有關的氨基酸及11個保守的氨基酸[16]，第313位保守的天冬氨酸是決定催化活性大小的關鍵氨基酸[17].蛋白質的二級結構經SPOMA軟件分析顯示，JsMVD蛋白主要以α-螺旋、無規則卷曲、延長鏈和β-折疊構成，分別占37.68%、17.54%、4.74%和4.27%(圖2).

為進一步研究JsMVD基因與其他植物同源基因的親緣關系，分別選取不同植物MVD基因編碼的氨基酸序列，采用鄰近連接法構建系統進化樹.結果(圖3)顯示：JsMVD基因與野生油橄欖、丹參、假馬齒莧聚為一類，表明這些植物之間的親緣關系較近；與野生油橄欖的親緣關系最近，可能由于兩者同為木犀科植物，但僅以43%的自展值連接，這可能與野生油橄欖的發源地更偏為地中海氣候地區有關.

2.3 JsMVD基因啟動子的分離及其順式作用元件分析

以茉莉花基因組DNA為模板，經3輪巢式擴增后獲得長度為893 bp的JsMVD基因啟動子序列(圖4).經PlantCare網站在線分析顯示，JsMVD基因啟動子序列包含啟動子核心元件TATA-box和啟動子增強元件CAAT-box，符合啟動子的特征.該區域含有多種激素響應元件，如脫落酸響應元件ABRE，赤霉素響應元件GARE和TATC-box，生長素響應元件TGA-box；還含有多個光響應元件，如Box I、Sp1、G-box和I-box等；此外，還含有干旱脅迫響應元件MBS、胚乳表達調控元件Skn-1和生物鐘調控元件Circadian(表1).

圖2 JsMVD與其他植物MVD的同源比對Fig.2 Homology comparison on JsMVD protein with other plants

圖3 JsMVD與其他植物MVD氨基酸序列的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of JsMVD and MVD in other plants

圖4 JsMVD基因上游啟動子序列Fig.4 The sequence of upstream promoter element of JsMVD

表1 JsMVD基因啟動子區域順式作用元件Table 1 List of cis-acting elements in the upstream promoter element of JsMVD

2.4 JsMVD基因mRNA水平的表達量

2.4.1 不同組織的表達量 采用實時熒光定量PCR技術檢測茉莉花植株根、莖、葉、花蕾及成熟花等不同組織中JsMVD基因的表達量.結果(圖5)顯示，JsMVD基因在各組織中均有表達，在根中的表達量最低，在成熟花中的表達量最高，為根中表達量的20倍左右.

2.4.2 不同激素處理下的表達量 植物激素是植物體內的重要信號分子，可參與植物次生代謝過程.GA、IAA和ABA噴施茉莉花苞后，JsMVD基因在3種植物激素下均可被誘導表達，且ABA處理的表達量上升幅度最大；GA處理2 h后的表達量最大；IAA和ABA處理4 h后的表達量最大，隨后呈下降趨勢，但表達量仍高于對照組(圖6).

圖5 不同組織JsMVD基因的表達量Fig.5 Expression levels of JsMVD in different tissues

圖6 GA、IAA和ABA誘導下JsMVD基因的表達量Fig.6 Expression levels of JsMVD induced by GA，IAA，and ABA

3 討論

MVD作為甲羥戊酸途徑中的最后一個催化酶，參與生物體內類異戊二烯化合物的合成代謝，其在生物體內的表達水平影響類異戊二烯化合物的生成[17].本試驗從茉莉花中克隆得到JsMVD基因，定位于細胞質中，含有GHMP超激酶家族中典型的GHMP超激酶N-端和C-端保守結構域.NCBI同源比對結果顯示，JsMVD基因編碼的氨基酸序列與其他植物的相似性極高，其中與野生油橄欖的相似性達到88%，且含有與其他物種共有的保守氨基酸序列，這說明MVD基因在進化過程中是相對保守的.MVD蛋白含有一個保守氨基酸殘基天冬氨酸，為催化活性高低的關鍵位點，但在不同生物中該活性位點不同，如在表皮葡萄球菌中，其MVD蛋白的保守位點為第283位氨基酸[18]；在滇龍膽中，其MVD蛋白相應的保守氨基酸殘基位于第315位；而在JsMVD蛋白中，該氨基酸殘基位于第313位，這說明MVD蛋白具有類似的催化機制.

本試驗首次成功分離了JsMVD基因的啟動子序列，該序列包含Box I、Sp1、G-box和I-box等4種光響應元件，包含8個調控位點，表明光照可能是調控JsMVD基因表達的要素之一.李志棟等[9]研究表明，刺五加(Eleutherococcus senticosus)中的MVD基因啟動子序列包含2個茉莉酸甲酯響應元件；而Jin et al[19]研究表明，噴施適當濃度的Me-JA后，刺五加中的皂苷類化合物明顯升高；Shi et al[6]用不同濃度Me-JA處理靈芝，高濃度(150 μmol·L-1)的Me-JA可促進靈芝MVD基因的表達，而低濃度(100 μmol·L-1)的Me-JA則抑制其表達.在JsMVD基因啟動子序列中并未發現Me-JA響應元件，卻含有生長素和赤霉素響應元件，這可能是茉莉花與刺五加親緣關系較遠的緣故.在JsMVD基因啟動子序列中還含有與生殖有關的順式作用元件，如胚乳表達元件Skn-I，在刺五加MVD基因啟動子序列中同樣含有[9]，但在靈芝中未發現[6].

前人在研究茉莉花萜類化合物合成相關基因的表達模式時多以茉莉花開放時間為對象[13-14]，而對其表達空間少有研究.本試驗在茉莉花植株的不同組織中均檢測到JsMVD基因的表達，但表達量存在顯著差異，在花瓣中大量表達，這與邢朝斌等[11]的“MVD基因具有組織特異性表達”的研究結果相符.Shi et al[6]在靈芝MVD基因上游啟動子序列中發現了Me-JA順式作用元件，并用Me-JA處理靈芝，證明了其對靈芝MVD基因的誘導表達.在JsMVD啟動子序列中發現IAA、GA和ABA等植物激素響應元件，茉莉花花苞噴施IAA、GA和ABA后，JsMVD基因的表達量均顯著高于對照組，這說明JsMVD基因的表達受這3種植物激素的誘導.IAA和GA作為促進生長的激素，可明顯誘導基因的表達，但ABA作為一種生長抑制劑，多參與植物逆境脅迫活動，卻能誘導茉莉花萜類化合物合成基因的表達，這可能與萜類化合物具有多種生理作用相關[20].

本試驗首次克隆了JsMVD基因全長cDNA序列，并成功分離出其上游啟動子區域，證實JsMVD基因在不同器官和不同生長發育時期均有表達，但表達量存在顯著差異.本試驗結果可為闡明MVD基因表達對茉莉花萜類化合物合成的影響提供參考.