半滑舌鰨gata5基因的克隆及表達分析

董忠典，張 寧，崔忠凱，徐文騰，陳松林

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半滑舌鰨基因的克隆及表達分析

董忠典1,2,3，張 寧1,2,3，崔忠凱2,3，徐文騰2,3，陳松林2,3

（1. 廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2. 中國水產科學研究院 黃海水產研究所，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術國家實驗室 / 海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，山東 青島 266071）

【】研究半滑舌鰨（）基因（）的序列特征及該基因在半滑舌鰨性腺分化、成熟過程中的表達模式?！尽客ㄟ^克隆獲得csgata5編碼區序列，利用熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測mRNA在不同類型性腺、胚胎和性腺發育中的表達模式，借助原位雜交技術定位mRNA表達的細胞類型?！尽靠寺～@得cDNA序列1 777 bp，包含1 167 bp的編碼區（Coding sequence，CDS），262 bp 的5′UTR 和348 bp的 3′UTR區，預測編碼388個氨基酸殘基（aa），分子質量為41.9 ku，等電點為8.90，在C端含有兩個典型的GATA鋅指結構域；基因組分析顯示位于半滑舌鰨10號染色體上，包含7個外顯子和6個內含子區。RT-qPCR分析顯示mRNA在2齡雄魚和偽雄魚精巢中表達高于卵巢；mRNA主要定位在卵母細胞、精原細胞和精子中。胚胎發育過程中，mRNA表達在1細胞期至囊胚期呈下降趨勢，之后上升，至原腸胚期達到峰值，隨后降低并維持較低水平至孵化出膜。在精巢發育過程中，mRNA表達水平呈升高趨勢，在1齡達到檢測的峰值；在卵巢發育過程中，mRNA表達趨勢類似精巢，表達水平低于同期精巢?！尽繀⑴c半滑舌鰨原腸胚期的組織器官分化，具有促進原始生殖細胞向雄性生殖細胞分化及雄性生殖細胞發育的作用。

半滑舌鰨；；RT-qPCR；原位雜交；性腺分化

半滑舌鰨（）是我國重要海水養殖對象，其生長具有顯著的性別二態性，1齡雌魚的體重及生長速度是雄魚的2~4倍[1]。半滑舌鰨性染色體組成類型是ZZ/ZW型，即遺傳雌魚為異型染色體ZW型，遺傳雄魚為同型染色體ZZ型[2]。有些遺傳雌性的半滑舌鰨在人工養殖條件下其性腺會發育成精巢，這種魚稱為偽雄魚[3]。研究發現，偽雄魚可以產生精子繁殖后代，且后代中偽雄魚比例更高，養殖中偽雄魚的存在會導致養殖群體雄性比例增加，影響產業的健康發展[4]。因此，研究半滑舌鰨的性別決定和分化機制，發現與半滑舌鰨性別決定、分化相關的基因，培育高雌比例半滑舌鰨品種至關重要。

通過AFLP、微衛星及基因組測序技術篩選可獲得半滑舌鰨遺傳性別鑒定的分子標記[5-7]。Shao等[4]還利用半滑舌鰨的全基因組甲基化測序初步揭示了甲基化與半滑舌鰨性反轉的關系。目前已經在半滑舌鰨中鑒定了多個性別相關的基因，如、、、、、、等[8-14]。

GATA家族是一類能夠識別目標靶基因啟動子區域GATA基序[T/A(GATA)A/G]，并與之結合的一類轉錄調節因子，在脊椎動物的細胞增殖、生殖細胞分化和繁殖等生命活動中發揮重要作用[15-18]。脊椎動物GATA家族主要包含6種GATA基因，可以分為GATA1/2/3亞家族和GATA4/5/6亞家族[19]，其中GATA4/5/6主要表達于心臟和性腺等內胚源組織，對脊椎動物性腺生長和分化起重要作用[20-24]。GATA4能夠通過和剪接因子（splicing factor 1，SF1）的協同作用激活抗穆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）的表達，引發繆勒氏管的單向退化從而影響脊椎動物性別分化。GATA4和GATA6可以通過調節支持細胞和間質細胞來促進精子的成熟[23-30]。GATA5最早被發現表達于非洲爪蟾（）和原雞（）的心臟、腸中，在其他鳥類和兩棲動物相同組織中也有表達，而關于GATA5在性腺發育及生殖過程中的研究較少[31-32]。在小鼠（）中，純合GATA5突變體是可育的，但雌性表現出明顯的泌尿生殖系統異常，雄性泌尿生殖系統不受影響[32]。

本研究以半滑舌鰨為研究對象，利用分子克隆方法獲得編碼序列，熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測了該基因在胚胎和性腺發育過程中的表達模式，通過原位雜交技術明示在精巢和卵巢中的細胞定位，以期為進一步闡明魚類在性腺分化及繁殖過程中的功能提供數據和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用半滑舌鰨取自山東海陽黃海水產有限公司提供。成魚（2齡）半滑舌鰨雌、雄、偽雄魚各3尾，經麻醉劑MS-222麻醉后解剖。取一側性腺組織于液氮速凍保存用于RNA提取，另一側性腺組織用質量分數4％多聚甲醛PFA固定；分別收集不同發育時期的胚胎（1細胞、32細胞期、囊胚期、原腸胚期、胚體雛形期、心跳期、晶體期、腦分化期、胚胎扭動期、孵化出膜）40~50枚，液氮速凍保存，用于RNA提取。不同生長時期（52、80、126、150、180、210 d和1 a）性腺取樣如下：解剖后取一側性腺于液氮中速凍保存，用于RNA提??；另一側用質量分數2％的戊二醛固定，用于生理性別鑒定；取部分鰭條于體積分數95%的酒精中保存，用于基因組DNA提取。

1.2 引物設計及合成

根據mRNA序列（Genebank: XM_0250 59544）及半滑舌鰨基因組數據（GCA_000523025.1）設計引物，以（Genebank: XM_008307613.1）作為定量的內參基因[14]，引物序列見表1，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物及用途

1.3 半滑舌鰨生理及遺傳性別鑒定

半滑舌鰨性腺組織用質量分數2％戊二醛固定12 h后參考Zhang[33]方法進行切片制備，觀察生理性別；遺傳性別鑒定參考文獻[7]。

1.4 csgata5克隆及分析

參照Trizol試劑操作說明（Invitrogen，上海）提取各樣本總RNA，經電泳和濃度測定后，參照PrimeScriptTMRT regent kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）說明書進行cDNA合成。以2齡精巢cDNA為模板，以、為引物對，進行PCR擴增。反應體系50.0 μL：10× LA Buffer 5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4.0 μL，上下游引物（10.0 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 3.0 μL，LATaq E 0.5μL，ddH2O 35.5 μL。反應條件：95 ℃預變性 2 min；變性95 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個循環，72 ℃總延伸 10 min；4 ℃保存。PCR產物經切膠回收純化后鏈接pEASY-T1載體并轉化至大腸桿菌，并將陽性克隆送至金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結果用DNASTAR進行結果比對拼接，根據驗證后序列設計定量、原位雜交引物（表1）用于后續分析用ChromasPro檢測測序質量，用DNASTAR對測序結果進行拼接，經BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）確定序列準確后，Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進行氨基酸比對，進一步采用鄰位連接法（Neighbor-Joining，NJ）構建GATA4/5/6亞家族系統進化樹，各節點置信度采用bootstrap重抽樣1 000次獲得。

1.5 csgata5 mRNA表達模式分析

通過RT-qPCR方法檢測mRNA在2齡雌、雄、偽雄半滑舌鰨性腺中的表達模式，以及在胚胎和性腺發育不同時期表達水平的變化。RT-qPCR反應在7500 Fast Real-time PCR儀（Applied Biosystems，美國）上進行。PCR反應體系如下：7.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)，上、下游引物（10.0 μmol/L）各0.6 μL，0.3 μL ROX Reference Dye II，cDNA 1.5 μL，ddH2O 4.5 μL。RT-qPCR反應條件：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。以作為內參基因對mRNA表達水平進行校正，基因相對表達水平用2-ΔΔCt計算，數據用SPSS 19.0進行統計學分析。

1.6 csgata5 mRNA在性腺中的定位檢測

以&為引物，以精巢cDNA為模板進行PCR擴增，用和對純化后PCR產物和pBluescript II SK（+）質粒進行雙酶切，連接轉化取陽性克隆測序獲得原位雜交重組質粒，參照羅氏體外轉錄試劑盒（Roche Diagnostics GmbH，德國）操作說明進行地高辛標記探針的合成，原位雜交具體步驟參見Dong等[14]的方法。

2 結果與分析

2.1 csgata5序列特征分析

通過克隆測序獲得完整編碼區（CDS）（1 167 bp）和部分5′UTR（262 bp）、3′UTR（348 bp）區的cDNA序列共1 777 bp（圖1）；基因組分析表明定位在半滑舌鰨10號染色體上，包含7個外顯子和6個內含子區，蛋白編碼起始于第2外顯子，終止于第7外顯子上（圖2）。預測編碼388個氨基酸殘基（aa），分子質量為41.9 ku，等電點為8.90。在第 190~214 aa 和 245~269 aa 位置分別含有兩個典型的GATA鋅指結構域（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys）。

大寫字母表示完整編碼區CDS，小寫字母表示5′UTR和3′UTR，起始密碼子和終止密碼子用方框標注，GATA鋅指結構域用下劃線表示

2.2 GATA家族蛋白序列比對和進化分析

對半滑舌鰨GATA家族基因結構分析，結果顯示GATA1/2/3編碼區包含5個外顯子；GATA4/5/6亞家族基因編碼區包含6個外顯子（圖2），蛋白序列分析顯示半滑舌鰨GATA家族蛋白的C-端均含有兩個典型的GATA鋅指結構域（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys）（圖3）。

圖2 半滑舌鰨GATA家族基因結構示意

方框表示GATA鋅指結構域，箭頭表示保守半胱氨酸位點

在不同物種中，GATA4/5/6亞家族系統進化樹分析（圖4）顯示，GATA4/5/6蛋白分為兩個分支，GATA6蛋白聚類在一起形成進化樹的一個分支，GATA4和GATA5蛋白聚類在一起作為進化樹的另一個分支。在GATA5蛋白中，半滑舌鰨GATA5蛋白首先和硬骨魚類GATA5蛋白聚類在一起，隨后和爬行類、鳥類、兩棲類及哺乳類的GATA5蛋白聚類在一起。進一步對不同物種及其上下游基因進行共線性分析，結果顯示（圖5），不同物種中與其鄰近的幾個基因具有保守的共線性關系。在所比對物種中下游均為基因，隨后在魚類中依次為、、；在其他脊椎動物中則為、、。在上游區域中基因排列在不同物種中有較大差異：相比于斑馬魚（）、西部錦龜（）、原雞、小鼠、智人（）半滑舌鰨基因和基因之間存在多個基因的插入。

圖4 GATA4/5/6家族成員系統進化樹

圖5 gata5與其鄰近基因在半滑舌鰨和其他脊椎動物中共線性關系

2.3 csgata5 mRNA表達檢測

對mRNA在2齡半滑舌鰨不同性腺中的表達進行定量檢測，以基因對進行校正[14]。結果顯示mRNA在精巢中表達水平顯著高于卵巢（＜0.05），在雄性和偽雄魚精巢中表達水平相近（圖6A）。在胚胎發育不同階段，mRNA在原腸期表達最高（圖6B）（＜0.05）；mRNA在受精卵到囊胚期階段表達水平下降，在原腸胚期表達突然升高，隨后降低并維持較低水平表達至孵化出膜，這其中在晶體期mRNA相對表達水平相比于其他檢測時期較高。在精巢發育過程中，mRNA隨著發育進行表達水平逐漸升高，在1齡時期達到檢測的最高表達水平（圖6C）（＜0.05），mRNA在相同發育時期的卵巢中表達水平低于卵巢（圖6C），mRNA在52~210 d時期的卵巢中表達維持在較低的水平，在1齡卵巢中表達水平有顯著升高（圖6C）（＜0.05）。

凡有一個標記相同字母即為差異不具統計學意義（P > 0.05）

2.4 csgata5 mRNA在性腺細胞的定位

利用合成的RNA探針對2齡半滑舌鰨雌魚卵巢和雄精巢進行原位雜交，結果如圖7顯示，正義探針在卵巢和精巢中均無雜交信號（圖7A，C）；反義探針在卵巢的卵母細胞中有較弱的雜交信號（圖7 B），在雄魚精巢的精原細胞和精子中有較強的雜交信號（圖7 D）。

A：2齡雌魚正義探針雜交結果；B：2齡雌魚反義探針雜交結果；C：2齡雄魚正義探針雜交結果；D：2齡雄魚反義探針雜交結果；OC：卵母細胞；SP：精子；SG：精原細胞；標尺：100 μm

3 討論

本研究獲得了完整的編碼區序列，定位在半滑舌鰨10號染色體上，包含7個外顯子和6個內含子區，蛋白編碼起始于第2外顯子，終止于第7外顯子上。在半滑舌鰨基因組中共發現7個家族成員GATA1/2a/2b/3/4/5/6，都定位在常染色體上。半滑舌鰨GATA1/2/3和GATA4/5/6兩個亞家族基因編碼區分別為5個和6個外顯子，在半滑舌鰨中含有兩個成員，即和，這是因為在魚類中發生了一次復制[34]。在尼羅羅非魚中同樣鑒定了7個GATA家族成員，即GATA1/2a/2b/3/4/5/6[35]。GATA4/5/6亞家族系統進化分析顯示，GATA成員在物種間的保守性要高于在同一物種內GATA家族成員之間的保守性。在進化關系上GATA4/5/6亞家族之間GATA4和GATA5在進化關系上相比于GATA6更接近。

mRNA在2齡半滑舌鰨精巢中的表達水平顯著高于卵巢，這與半滑舌鰨GATA4/5/6亞家族中和mRNA的表達模式相似[23-24]，GATA4和GATA6可以通過調節支持細胞和間質細胞來促進精子的成熟[23-30, 36-37]，說明GATA5在半滑舌鰨性腺中發揮了相似的功能。性腺切片原位雜交結果顯示mRNA主要定在生殖細胞中。

在脊椎動物胚胎發育過程中，從受精開始到卵裂期很多基因的表達都受母源效應影響[38-39]。本研究中，mRNA主要在半滑舌鰨成熟卵巢的卵母細胞中表達，通過母源遺傳給后代，表現為mRNA在卵裂期至囊胚期呈較低表達水平并持續下降。在魚類胚胎發育過程中，原腸胚期主要發生內胚源和中胚源組織器官的分化，而GATA4/5/6亞家族基因主要在內胚源和中胚源組織中表達，故而在該階段mRNA表達水平顯著升高。

雌性半滑舌鰨在孵化后120 d，卵巢腔形成并開始出現初級卵母細胞，200 d左右卵巢腔分化完成，卵巢達到1期卵巢[40-41]。本研究中，mRNA在52 d至210 d卵巢中維持在較低表達水平，在1齡時期表達水平達到檢測的峰值，因此，可能不參與半滑舌鰨卵巢的分化，而是在卵母細胞的成熟中發揮作用。在雄性半滑舌鰨發育過程中，孵化后120 d精巢開始出現精小葉，標志著精巢開始分化[41]，在150 d精巢內形成多個精小葉，精小葉中含有多個精原細胞和初級精母細胞形成的精小囊，在190 d精巢中出現了初級精原細胞、次級精原細胞、初期精母細胞和二期精母細胞，在225 d有成熟精子發生[42]。本研究中，mRNA在半滑舌鰨精巢發育過程中的表達變化，可能說明該基因在半滑舌鰨原始生殖細胞向精原細胞分化以及初級精母細胞產生過程中發揮作用，并且參與了隨后的精子發生過程，在維持精子成熟中具有重要作用。綜上，具有促進原始生殖細胞向雄性生殖細胞分化的作用，并維持生殖細胞的成熟。

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Cloning and Expression Analysis ofin Chinese Tongue Sole

DONG Zhong-dian1,2,3, ZHANG Ning1,2,3, CUI Zhong-kai2,3, XU Wen-teng2,3, CHEN Song-lin2,3

（1.,524088,; 2.,,266071,; 3./,266071,）

【】In order to elucidate the gene function ofof Chinese tongue sole（）（）, the sequence characteristics and the expression patterns of this gene in Chinese tongue sole were studied.【】The coding region ofwas obtained by cloning and the expression pattern ofmRNA in embryonic development and gonadal development was detected by real-time PCR（RT-qPCR）.hybridization was used to localize the expression ofmRNA in the gonads.【】ThecDNA sequence is 1 777 bp in length and contains the entire coding region of 1 167 bp, the 262 bp 5′UTR and 348 bp 3′UTR. The location ofis on chromose 10, and it includes seven exons and six introns. The predicted protein ofcontains 388 amino acid residues（aa）, the molecular weight is 41.9 ku, the isoelectric point is 8.90, and it has two typical GATA zinc finger binding domains at the C-terminus. Phylogenetic analysis shows that the same GATA proteins are clustered together, and the clustering pattern is independent of species. The expression levels ofmRNA are higher in the testis of two-years old male and pseudomale than in the ovary of two-years old female and it is mainly localized in the oocytes, spermatogonia and sperm. During embryonic development, the expression levels ofmRNA decrease from the cleavage stage to the blastocyst stage, peak at the gastrula stage, and then decrease and maintain at a lower level until hatching. During the development of testis, the expression levels ofmRNA tend to increase, reaching the peak of detection at the age of one-year old. In the ovary, the expression profile ofmRNA is similar to that of the testis, and the expression level is lower than that of the testis.【】These results show thatmay be involved in the differentiation of organs in the gastrula stage of Chinese tongue sole; it has the effect of promoting the differentiation of primordial germ cells into male germ cells and the development of male germ cells.

;; RT-qPCR;hybridization; gonadal differentiation

S917.4

A

1673-9159（2019）03-0006-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.002

2019-03-09

黃海水產研究所科研事業單位基本科研業務費項目（20603022017003）；山東省泰山學者攀登計劃項目；國家自然科學基金青年科學基金項目（31402293）；廣東海洋大學博士啟動項目

董忠典（1987－），男，博士，講師，研究方向為水產生物技術研究。E-mail：dzhd888@163.com

陳松林（1960－），男，博士，研究員，研究方向為水產生物技術研究。E-mail：chensl@ysfri.ac.cn

董忠典，張寧，崔忠凱，等. 半滑舌鰨基因的克隆及表達分析[J]. 廣東海洋大學學報，2019，39（3）：6-14.

（責任編輯：劉朏）