低水平乙型肝炎病毒DNA 慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒RNA 水平及其影響因素研究

彭亞夢，袁浩*，周毅峰，龍貞亦，吳思弦

目前乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球最嚴重、最普遍的健康問題之一［1］。每年因HBV 感染而導致其肝功能失代償、肝硬化、肝衰竭及肝細胞癌等相關疾病死亡的患者有50 萬～120 萬人［2-3］。導致HBV 持續性感染的根本原因是共價閉合環狀DNA（cccDNA）的持續性存在［4］，現有的血清標志物和病毒學復制分子學檢測難以準確反應肝細胞內cccDNA 的存在狀態，有研究表明盡管慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中HBV DNA 為低濃度狀態，但體內cccDNA 仍復制活躍，且其肝臟組織學證據仍提示有炎癥及纖維化傾向［5］。監測肝組織內cccDNA 需要進行肝組織活檢，臨床上難以連續實施，肝組織內cccDNA 分布不均以及松弛環狀雙鏈DNA（rcDNA）的存在也為其檢測增加了難度［6］。

2017年歐洲肝病研究協會（EASL）新發布的臨床實踐指南將血清HBV RNA 定義為一種新型的血清標志物，并指出其主要成分前基因RNA（pgRNA）以病毒樣顆粒釋放入血［1］。pgRNA 為cccDNA 的直接轉錄體，能精確地反映肝細胞中cccDNA 的存在狀態，血清HBV RNA 的檢測將為CHB 患者體內病毒復制狀態及其治療效能提供更為直接的證據［7］。為此，本研究探討當CHB 患者血清HBV DNA 處于低復制水平時，血清HBV RNA 的存在狀態、影響因素，旨在為臨床診治CHB 提供新思路。

本研究創新點：

血清乙型肝炎病毒（HBV）RNA 為一種新型的血清標志物，其主要成分前基因RNA（pgRNA）為共價閉合環狀DNA（cccDNA）的直接轉錄體，能精確地反應肝細胞中cccDNA 的存在狀態。血清HBV RNA作為檢測HBV 感染的一項新的血清標志物，其在不同乙肝e 抗原（HBeAg）狀態的患者中，與其他血清標志物的相關性等問題研究較少，本文就這一問題進行了探討，結果表明血清HBV RNA 在不同HBeAg 狀態的患者中存在較大差異，且與其他血清標志物存在一定的相關性。下一步將深入分析不同藥物治療下血清HBV RNA 水平的動態變化等問題。

1 對象與方法

1.1 研究標準 納入標準：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》（以下簡稱《防治指南》）［8］中的相關診斷標準；明確HBV 感染至少6 個月；血清HBV DNA＜1.0×104U/ml。排除標準：其他嗜肝病毒感染；酒精性肝??；非酒精性脂肪性肝??；藥物性肝??；代謝性肝病及自身免疫性肝病，或其他原因所導致的肝損傷；HIV 感染者；原發性膽汁性肝硬化患者［8］。

1.2 研究對象 回顧性選取2018年5—7月于湖南師范大學附屬第一醫院湖南省人民醫院確診且符合研究標準的CHB 患者?；颊呔幱贖BV DNA 低水平狀態，入院后均按照《防治指南》［8］進行治療。本研究患者均對本研究知情同意。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 采集患者清晨空腹靜脈血 5 ml，加入抗凝管中，4000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm）后收集上清液，分裝于1.5 ml 無酶EP 管中，置于-80 ℃保存待檢。

1.3.2 HBV 血清標志物（HBV-M）檢測 采用北京萬泰生物技術有限公司生產的全自動化學發光免疫分析儀Caris200，試劑為購于廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司的乙型肝炎診斷試劑盒，應用化學發光微粒子免疫檢測法進行檢測，其中乙肝表面抗原定量（qHBsAg）檢測有效范圍為0.05～250.00 U/ml，乙肝e 抗原（HBeAg）為定性檢測。

1.3.3 肝功能指標的檢測 采用貝克曼5800 全自動生化分析儀，試劑購自上?？迫A生物工程股份有限公司。以血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）作為觀察指標，二者均應用雙試劑速率法進行檢測。

1.3.4 血清HBV DNA 檢測 采用上海宏石醫療科技有限公司生產的 SLAN Real-Time PCR Detection System 96熒光定量檢測儀，試劑購自湖南圣湘生物科技股份有限公司，應用qPCR 法，由獲得PCR 上崗證工作人員嚴格按說明書操作進行檢測。該試劑盒檢測下限為1.0×102U/ml。

1.3.5 血清HBV RNA 的檢測 采用上海宏石醫療科技有限公司生產的SLAN Real-Time PCR Detection System 96 熒光定量檢測儀，試劑購自湖南圣湘生物科技股份有限公司，應用RT-qPCR 法，由獲得PCR 上崗證工作人員嚴格按說明書操作進行檢測。該試劑盒的檢測下限為0.5×102U/ml。

1.4 觀察指標 依據患者HBeAg 情況將患者分為HBeAg 陽性患者和HBeAg 陰性患者，比較其年齡、性別、血清ALT 水平、血清AST 水平、血清qHBsAg 水平、血清HBV DNA 水平、血清HBV RNA 水平、血清HBV RNA 水平低于檢測下限發生率，分析CHB 患者血清HBV RNA 水平及其低于檢測下限的影響因素，以及血清HBV RNA 水平與ALT、AST、qHBsAg、HBeAg、HBV DNA 的相關性。

1.5 統計學方法 采用 SPSS 19.0 統計學軟件進行數據處理，GraphPad Prism 6.0 繪制統計圖。CHB 患者血清標志物數據均進行對數轉換（log）。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t 檢驗；相關性分析采用Pearson 相關分析；非正態分布的計量資料經對數轉換后以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，相關性分析采用Spearman 秩相關分析；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；采用線性回歸分析及多因素Logistic 回歸分析血清HBV RNA 水平及其低于檢測下限的影響因素。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CHB 患者臨床資料 本研究共納入HBV DNA 檢測處于低水平狀態的CHB 患者72 例，平均年齡為（49.5±13.5）歲；男46 例，女26 例；HBeAg 陽性12 例，HBeAg 陰性60 例。HBeAg 陽性與HBeAg 陰性患者性別、血清ALT 水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；HBeAg 陽性患者年齡小于HBeAg 陰性患者，血清AST、qHBsHg、HBV RNA 水平高于HBeAg 陰性患者，血清HBV DNA 水平、血清HBV RNA 水平低于檢測下限發生率低于HBeAg 陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素分析 分別以年齡（賦值：連續性變量）、性別（賦值：男=1，女=2）、ALT（賦值：連續性變量）、AST（賦值：連續性變量）、qHBsAg（賦值：連續性變量）、HBeAg（賦值：HBeAg 陰性=0，HBeAg 陽性=1）、HBV DNA（賦值：連續性變量）為自變量，以血清HBV RNA 為因變量（賦值：連續性變量）進行單因素線性回歸分析，結果顯示，年齡、qHBsAg、HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素（P＜0.05）。將單因素分析中P＜0.200 的自變量納入多因素線性回歸分析，結果顯示，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素（P＜0.05，見表2）。

表2 CHB 患者血清HBV RNA 水平影響因素的單因素和多因素線性回歸分析Table 2 Univariate and multivariate linear regression analysis of factors influencing serum HBV RNA levels in CHB patients

表1 HBeAg 陽性與HBeAg 陰性患者臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical data between HBeAg positive and HBeAg negative patients

2.3 CHB 患者血清HBV RNA 水平低于檢測下限的影響因素分析 以年齡（賦值：連續性變量）、性別（賦值：男=1，女=2）、ALT（賦值：連續性變量）、AST（賦值：連續性變量）、qHBsHg（賦值：連續性變量）、HBeAg（賦值：HBeAg 陰性=0，HBeAg 陽性=1）、HBV DNA（賦值：連續性變量）為自變量，以CHB 患者血清HBV RNA 是否低于檢測下限（賦值：是=1，否=0）為因變量，進行多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，qHBsAg〔OR=1.682，95%CI（1.055，2.681），P=0.029〕、HBeAg〔OR=3.85，95%CI（1.068，13.880），P=0.039〕是CHB 患者血清HBV RNA 水平低于檢測下限的影響因素。

2.4 CHB 患者血清HBV RNA 水平與ALT、AST、qHBsAg、HBeAg、HBV DNA 的相關性分析 CHB 患者血清中ALT 為1.44（1.21，1.74）U/L，AST 為1.43（1.29，1.68）U/L，qHBsAg 為2.87（1.34，3.33）U/ml，HBV DNA 為2.85（2.39，3.19）U/ml，HBV RNA 為1.70（1.70，1.95）U/ml。CHB 患者血清HBV RNA 水平與qHBsAg（rs=0.322，P=0.006）、HBeAg（rs=0.235，P=0.047）相關，與ALT（rs=0.038，P=0.752）、AST（rs=0.189，P=0.557）、HBV DNA（rs=0.058，P=0.629）水平均無相關關系。

在HBeAg 陽性患者中，血清HBV RNA 水平與qHBsAg（rs=0.848，P＜0.001）、HBeAg（rs=0.725，P=0.008）相關，與ALT（rs=0.051，P=0.876）、AST（rs=0.046，P=0.702）、HBV DNA（rs=0.383，P=0.219）無相關關系。在HBeAg 陰性患者中，血清HBV RNA 水平與ALT（rs=-0.020，P=0.878）、AST（rs=-0.080，P=0.542）、qHBsAg（rs=0.151，P=0.251）、HBeAg（rs=0.083，P=0.529）、HBV DNA（rs=0.145，P=0.268）均無相關關系。

3 討論

目前CHB 患者的治療仍面臨著停藥難、易反彈等難題，現有的血清標志物難以準確反映肝細胞內cccDNA 的存在狀態［9］。1996年德國學者KOCK 等在研究HBV 是否能感染人外周單個核細胞時在CHB 患者血清中檢測到了HBV RNA［10］。近年來，國內外學者對于血清HBV RNA 進行了廣泛研究，不斷改進和優化其檢測方式，同時對其臨床意義進行了深入探 索［7，9，11-12］。

《防治指南》［8］提出CHB 患者治療的理想終點是HBeAg 陽性和HBeAg 陰性的患者停藥之后實現持久的HBsAg 清除，伴或不伴HBsAg 的血清學轉換。然而HBsAg 并不能完全代表肝細胞內HBV 的復制情況，在實際治療過程中HBsAg 轉陰率并不理想。本研究比較了當HBV DNA 低水平狀態時，在HBeAg 陽性和 HBeAg 陰性的CHB 患者血清HBV RNA 水平，并發現二者血清HBV RNA 水平差異顯著。本研究結果顯示，HBeAg 陽性患者年齡小于HBeAg 陰性患者，與楊建功等［13］得出的HBeAg 陰性發生率與年齡有關的結果相似。進一步進行影響因素分析結果顯示，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素。相關性分析顯示，CHB 患者血清HBV RNA 水平與HBeAg 相關；且在HBeAg 陽性患者中，血清HBV RNA 水平與HBeAg 相關，表明血清HBV RNA 水平能較準確反應CHB 患者體內病毒的復制狀態。HUANG 等［14］研究發現，在應用核苷及核苷酸類藥物（NAs）治療過程中，血清HBV RNA 水平或可作為預測HBeAg 發生血清學轉換的血清標志物［15］。

雖然從一定程度上來說，HBV DNA 也能反映體內cccDNA 的復制活性，且HBV RNA 的低檢出率是與此現象一致的，然而，HBV DNA 低于檢測下限僅表明該病毒的反轉錄過程被抑制，并不能反映cccDNA 的轉錄狀態，在反轉錄過程被抑制后，cccDNA 仍以HBV RNA 病毒樣顆粒的形式產生子代病毒，因此以現有病毒學應答為前提條件停藥后，疾病反彈和復發率較高［5，16-18］。 本研究結果顯示，CHB 患者血清HBV DNA 水平與血清HBV RNA 水平無相關關系，且在不同HBeAg 狀態的患者中，其血清HBV DNA 水平與血清HBV RNA 水平也無直線相關關系。這表明盡管HBV DNA 處于低水平或低于檢測下限的狀態，cccDNA 仍存在復制活性，導致HBV RNA 被檢出或處于較高水平。因此，HBV RNA 相較于HBV DNA 更能精確反應cccDNA 的存在狀態，能為CHB 患者抗病毒治療效果提供更有力的證 據［5，19-20］。

HBeAg 陰性患者血清HBV RNA 水平低于檢測下限的發生率高于HBeAg 陽性患者，可能是HBeAg 陽性患者體內cccDNA 轉錄活性相較于HBeAg 陰性患者活躍所導致，與其他學者的相關研究結論一致［21］。多因素Logistic 回歸分析結果顯示，qHBsAg 和HBeAg 是CHB患者血清HBV RNA 水平低于檢測下限的影響因素。本研究中CHB 患者血清HBV RNA 水平高于檢測下限的總檢出率為32%（23/72），與HUANG 等［18］研究中的檢出率相近，而LI 等［22］研究中的檢出率卻高達85.3%，該差異可能來源于樣本選取、人口學特征以及方法學等方面。

本研究結果顯示，HBeAg 陽性患者血清HBV RNA水平與HBeAg 相關，而在HBeAg 陰性患者中二者并無相關關系，這可能是由于HBeAg 不僅來自cccDNA，還可由整合的HBV 基因片段合成。研究表明，在HBV 感染的患者中，攜帶HBV DNA 整合片段的肝細胞大約占總肝細胞的1%，HBV DNA 整合后轉錄翻譯出HBeAg，這可能是臨床上導致其無法徹底清除的重要原因［23-24］。因此，HBeAg 對于評判患者是否達到臨床治愈水平有一定缺陷，而血清HBV RNA 為cccDNA 的直接轉錄體，相較于HBeAg 更能直接反應目前體內cccDNA 的復制活性。有學者建議將HBV RNA 納入臨床診斷、疾病進展監測和抗病毒藥物合理化停藥的應用中［25-27］。然而，其作為一項成熟的血清標志物運用于臨床還需要準確性、靈敏度更高，更加標準化的檢測方法以及進行更完善的前瞻性研究。

綜上所述，不同HBeAg 情況的低水平HBV DNA CHB 患者血清HBV RNA 水平存在較大差異，HBeAg 是CHB 患者血清HBV RNA 水平的影響因素，HBeAg、qHBsAg 是CHB 患者HBV RNA 低于檢測下限的影響因素。同時CHB 患者血清HBV RNA 水平與其他血清標志物存在一定的相關性。因此說明，低水平HBV DNA CHB 患者血清HBV RNA 水平一定程度上可反應CHB患者體內病毒的活躍狀態，可作為檢測HBV 感染的一項新的血清標志物。