植物乳桿菌發酵蘋果汁及菌體活性保持

崔樹茂，徐長悅，毛丙永，王順余，李淵，何建新，陸圓圓，張灝*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華，321015)

目前市場上益生菌的產品日益豐富，但是益生菌發酵飲品依然以發酵乳品為主。近年來，果蔬汁因含有豐富的維生素、膳食纖維、甾醇等營養物質，及更清爽的口感備受消費者喜愛。將益生菌與果蔬汁結合，研究開發益生菌發酵果蔬汁成為新的研究熱點，并具有廣泛的前景。高寅等[1]利用干酪乳桿菌發酵柑橘汁，并優化工藝，得到了富含乳酸菌的發酵柑橘汁飲品。張玉慧[2]利用植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合發酵藍莓汁，開發得到具有抗氧化、營養價值高、風味濃郁的新型乳酸菌飲料。但是，目前的乳酸菌發酵果蔬汁研究依然存在以下問題：(1)發酵時間長；(2)短時間發酵乳酸菌的增殖濃度低；(3)發酵用乳酸菌菌種為普通乳酸菌，不具有明確的益生功能；(4)得到的活性乳酸菌飲品，菌體在儲藏期內的活性保持較差。上述幾個因素均限制了益生菌發酵果蔬汁的產業化轉化，目前市場上含活性益生菌的發酵果蔬汁飲品依然是空白。

植物乳桿菌作為重要的益生菌，其來源于果蔬及自然發酵果蔬食品，利用其發酵果蔬汁更具有可行性。但是，不是所有的植物乳桿菌均具有益生功能，研究證明具有特定功效的植物乳桿菌發酵果蔬汁更具有研究和開發價值。植物乳桿菌CCFM8661被證明具有抗氧化、緩解鉛中毒等功能[3-6]，將其應用至果蔬汁發酵開發含活性菌飲品將賦予果蔬汁新的功效。蘋果汁富含單寧、膳食纖維和VA、VC、鐵和磷等多種營養成分，具有增加胃腸道蠕動、潤肺化痰、補充益氣等功效，且制備成本低。在益生菌發酵乳產品同質化的大環境下，植物乳桿菌CCFM8661與蘋果汁的結合不僅創造新的口味飲品，而且活性益生菌發酵蘋果汁亦會是一種具有排鉛健康功能的發酵飲品。

但是，蘋果汁酸度高，pH低，且缺少益生菌發酵所需的生長因子，使得植物乳桿菌發酵時間長、增殖的益生菌活菌數低，植物乳桿菌在蘋果汁中的快速增殖依然是個難題。另外發酵后蘋果汁的酸度很高，pH值更低，有機酸通過酸化細胞質，損害乳酸菌的生存能力，增加維持細胞內pH和抑制酶促反應所需能量的消耗[7]。因此，在發酵果汁的低酸環境中，大多數益生菌會迅速喪失活力。而益生菌產品需擁有足夠的活菌數(1×107CFU/mL)才可發揮保健作用，保證產品在貨架期內達到一定的活菌數是極其必要的。

目前有多種方式可以提高益生菌在酸性等不利環境下的耐受性，包括菌株選擇、加工過程中適當的壓力處理、添加蛋白或纖維素等保護劑，及制備微膠囊保護性載體等[8-11]。

本文的目的是在不明顯改變蘋果汁風味的前提下通過優化蘋果汁營養組成，使植物乳桿菌能夠在蘋果汁中快速增殖，并研究不同保護劑及微膠囊化對發酵蘋果汁中的植物乳桿菌在貯藏期內的活性保持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌CCFM 8661，江南大學食品生物技術中心保藏。

1.1.2 試劑

蘋果汁，無錫橙寶食品有限公司；分離乳清蛋白(WPI90)，美國Hilmar公司；抗性糊精，羅蓋特(中國)精細化工有限公司；酵母提取物，安琪酵母股份有限公司；MRS培養基，青島海博生物技術有限公司；海藻酸鈉、檸檬酸鈉、K2HPO4、CaCl2等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GRP-9160型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；K1100型全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；l?ser-om806m型冰點滲透壓測定儀，德國l?ser公司；FE-20型pH計，梅特勒-托利多集團；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌種子液的制備

從保菌管內吸取100 μL植物乳桿菌CCFM8661菌液，接種到5 mL MRS液體培養基中，在37 ℃條件下進行活化培養12 h，連續活化2次，將所得菌液離心，并用生理鹽水洗滌1次后離心，得植物乳桿菌菌泥，將其重懸于離心前等體積生理鹽水作為后續發酵種子液。

1.3.2 蘋果汁理化性質的測定

(1)pH值的測定：FE-20型酸度計直接測定；

(2)總糖含量的測定：取蘋果汁25 mL，采用斐林試劑法測定；

(3)蛋白質含量的測定：取蘋果汁20 mL，按照K1100型全自動凱氏定氮儀說明進行測定；

(4)滲透壓的測定：取澄清蘋果汁100 μL，采用滲透壓測定儀直接測定。

1.3.3 植物乳桿菌在添加無機鹽蘋果汁中生長的測定

向蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4及適量的檸檬酸鈉以調節蘋果汁pH至5.5，以不添加無機鹽蘋果汁為對照組。采用80 ℃滅菌15 min，冷卻后以體積分數1%接入植物乳桿菌活化種子液，置于37 ℃下恒溫培養16 h。從發酵10 h開始，每隔2 h取樣通過平板菌落計數法測定發酵蘋果汁中植物乳桿菌活菌數量。

1.3.4 植物乳桿菌在添加營養因子蘋果汁中生長的測定

向蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4、5 g/L酵母粉及適量的檸檬酸鈉以調節蘋果汁pH至5.5，以添加無機鹽但不添加營養因子的蘋果汁為對照組。采用80 ℃ 滅菌15 min，冷卻后以體積分數1%接入植物乳桿菌活化種子液，置于37 ℃下恒溫培養16 h。從發酵10 h開始，每隔2 h取樣通過平板菌落計數法測定發酵蘋果汁中植物乳桿菌活菌數量。

1.3.5 植物乳桿菌在添加微量元素蘋果汁生長的測定

向蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4、5 g/L酵母粉、0.05 g/L硫酸錳及適量的檸檬酸鈉以調節蘋果汁pH至5.5，以添加無機鹽、營養因子但不添加硫酸錳的的蘋果汁為對照組。采用80 ℃滅菌15 min，冷卻后以體積分數1%接入植物乳桿菌活化種子液，置于37 ℃下恒溫培養16 h。從發酵10 h開始，每隔2 h取樣通過平板菌落計數法測定發酵蘋果汁中植物乳桿菌活菌數量。

1.3.6 植物乳桿菌在添加不同保護劑發酵蘋果汁活性保持的分析

植物乳桿菌發酵蘋果汁結束后，無菌條件下分別加入滅菌的分離乳清蛋白(whey protein isolation,WPI)溶液和抗性糊精溶液，終質量濃度為10 g/L，以不添加保護劑發酵蘋果汁為對照，然后置于4 ℃貯藏。分別在0、3、7、1、21 d取樣通過平板菌落計數法測定植物乳桿菌在不同發酵蘋果汁貯藏期間的活菌變化。

1.3.7 植物乳桿菌微膠囊的制備

配制1.0%(質量分數)的海藻酸鈉溶液與5%的CaCl2溶液，在60 ℃條件下滅菌30 min，冷卻至室溫備用。

植物乳桿菌發酵蘋果汁結束后，在無菌環境下以8 000×g離心20 min，收集蘋果汁中植物乳桿菌菌泥，將上清發酵蘋果汁置于4 ℃冷藏待用。

將植物乳桿菌菌泥在無菌環境下按1∶1(質量比)分別添加至無菌的100 g/L抗性糊精溶液和WPI溶液，混合均勻?；旌暇鷳乙号c無菌的1%海藻酸鈉溶液按1∶5(體積比)混合均勻，用1 mL注射器將上述混合液滴入無菌的CaCl2溶液中，制備成直徑2 mm的微膠囊。

1.3.8 植物乳桿菌微膠囊在發酵蘋果汁貯藏期菌體活性測定

將1.3.7制備的微膠囊，無菌條件下用紗布過濾，將微膠囊重新投回發酵的蘋果汁中，4 ℃低溫貯藏。分別在0、3、7、14、21 d取樣，用消毒后的高剪切均質機剪切微膠囊至果汁內無肉眼可見顆粒，對未做微膠囊化處理的WPI組、抗性糊精組、空白對照組進行同樣轉速、時間的高剪切處理，然后通過平板菌落計數法測定植物乳桿菌活菌數。

1.3.9 植物乳桿菌在不同濃度保護劑制備的微膠囊內活性保持的測定

配制100、200、300 g/L的抗性糊精溶液，按照1.3.7 的方法制備不同濃度保護劑的植物乳桿菌微膠囊，按照1.3.8的方法測定其在發酵蘋果汁貯藏期菌體活性保持。

1.3.10 植物乳桿菌在不同粒徑大小的微膠囊內活性保持的測定

以最適保護劑濃度和海藻酸鈉濃度按照1.3.7的方法制備2和4 mm粒徑的植物乳桿菌微膠囊，按照1.3.8的方法測定其在發酵蘋果汁貯藏期菌體活性保持。

1.3.11 蘋果汁風味物質的測定

室溫下取5 g發酵蘋果汁樣品裝入20 mL的萃取小瓶中，同時加入1 g NaCl，采用固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)方法提取發酵蘋果汁中的風味成分，萃取頭是涂抹厚度為85 μm的CAR/PDMS纖維，自動進樣器將萃取頭插入密封的萃取瓶后，于50 ℃條件下，振蕩平衡30 min；將萃取頭暴露在頂部空間5 min。

氣譜條件為：Rtx-WAX毛細管柱；柱子規格：30 m×0.25 mm×0.25 mm，進口溫度為240 ℃，不分流，柱流速15.0 mL/min，載氣為氦氣；程序升溫：初始溫度30 ℃，保持3 min；15 ℃/min升溫至225 ℃，保持5 min。

質譜條件為：離子化方式EI，發射能量為70 eV，發射電流為200 μA，檢測器電壓為1.4 kV，離子源溫度240 ℃，質荷比30～500?；衔餀z索結果與NIST和Varian兩個標準譜庫進行匹配，相似度達到80%以上確認為目的化合物。以4 μL的0.025 g/L癸酸乙酯為內標，計算各風味物質的含量。

1.3.12 數據統計與分析

試驗中總糖的測定、總氮的測定、滲透壓的測定、pH的測定及生物量的測定均為3次生物學重復的平均值。實驗數據平均值與標準差均采用Excel計算并作圖。

2 結果與分析

2.1 蘋果汁的理化性質分析

植物乳桿菌的增殖需要碳源、氮源、無機鹽、生長因子和微量元素。因此研究植物乳桿菌CCFM8661能否發酵蘋果汁并進行富集，首先需要綜合分析蘋果汁的營養組成及與菌體增殖相關的理化性質。通過利用斐林試劑法、凱氏定氮法、冰點滲透壓儀、pH計分別測定了蘋果汁的總糖含量(115.52±0.5)g/L、總氮含量(0.02±0.0)g/L、滲透壓(849±12)g/L和pH值(4.01±0.1)。

蘋果汁內含有豐富的碳源，總糖含量達到(115.52±0.5) g/L，高于培養乳酸菌的MRS培養基含糖量(20 g/L)， 故蘋果汁中總糖含量不會成為抑制植物乳桿菌發酵的因素。而蘋果汁中總氮含量為(0.02±0.0)g/L， 較低的氮含量會影響菌體的增殖，同時蘋果汁中是否含有菌體增殖的生長因子亦是未知。

滲透壓是影響植物乳桿菌生長的重要因素，前期的研究表明植物乳桿菌CCFM8661可耐受的最高滲透壓達(2 414±25) mOsm/kg[12]。蘋果汁滲透壓為(849±12) mOsm/kg，故蘋果汁滲透壓不會限制菌體發酵增殖。

眾所周知，pH值是抑制乳酸菌生長的最重要的因素。而蘋果汁的pH值僅為(4.01±0.1)，遠低于植物乳桿菌生長最適pH值。因此，為提高植物乳桿菌在蘋果汁中的增殖，首先需要適當提高發酵體系的pH值。緩沖鹽和偏堿性的無機鹽的添加可能利于發酵蘋果中植物乳桿菌的增殖，且添加的無機鹽的種類和含量應符合添加劑國家標準。

2.2 無機鹽對蘋果汁中植物乳桿菌增殖的影響

K2HPO4和檸檬酸鈉被確認是可加入果汁的添加劑，二者的添加可提高蘋果汁的pH和緩沖能力。實驗表明，添加5 g/L K2HPO4和7 g/L檸檬酸鈉的蘋果汁pH值達5.5。在該條件下接菌發酵蘋果汁，結果見圖1。添加無機鹽調整蘋果汁的pH值，提高了植物乳桿菌CCFM8661的增殖，16 h時活菌數達到(3.2±0.0)×107CFU/mL，是未處理的對照蘋果汁的1.3倍。雖然無機鹽的添加對植物乳桿菌CCFM8661在果汁內的增殖起到了促進作用，但效果不顯著?？赡艿春蜕L因子的缺乏是主要的限制因素。

圖1 無機鹽對蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響Fig.1 Effect of inorganic salts on the growth of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in apple juice

2.3 營養因子對蘋果汁中植物乳桿菌增殖的影響

酵母粉不僅含有適宜植物乳桿菌增殖的氮源，且含有核苷酸、維生素等促進乳酸菌生長的重要的生長因子[13]。由圖2可知，添加酵母粉后顯著促進了植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中的增殖，在發酵12 h活菌數即達到(2.5±0.0)×109CFU/mL，是空白對照組的100倍。酵母粉的添加是植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中快速增殖的顯著因素，且添加量僅為5 g/L，不會對蘋果汁的口感產生顯著影響，是植物乳桿菌發酵蘋果汁的理想助劑。

圖2 酵母粉對蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響Fig.2 Effect of yeast extract on the growth of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in apple juice

2.4 微量元素對蘋果汁中植物乳桿菌增殖的影響

微量元素也是乳酸菌生長的關鍵因子，有研究表明Mn2+是乳桿菌菌體內關鍵酶的輔基[14]，可積極促進菌體細胞的生長。蘋果汁中添加適宜的微量元素Mn2+，顯著提高了植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中的增殖(圖3)，在發酵12 h活菌數達到(3.4±0.2)×109CFU/mL。

圖3 錳元素對蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響Fig.3 Effect of Mn on the growth of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in apple juice

綜上，在蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4和7 g/L檸檬酸鈉可調節蘋果汁的初始pH值至5.5，再輔以5 g/L酵母粉和0.05 g/L MnSO4可以顯著促進植物乳桿菌CCFM8661的增殖。在發酵12 h，發酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的活菌數達到(3.4±0.2)×109CFU/mL，是空白對照組的100多倍。

2.5 保護劑對發酵蘋果汁中植物乳桿菌活性保持的影響

蘋果汁發酵結束后，有機酸積累，pH降低，條件非常不利于植物乳桿菌的存活。即使4 ℃貯藏，在發酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的活性快速損失，在貯藏期的第7天存活率迅速下降至(14±0.3)%，貯藏第21天存活率下降至(5±1.1)%。添加保護劑的發酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的存活率整體高于空白對照組，在貯藏期前7天，兩者的存活率達60%左右，顯著高于未加保護劑的對照組別，表明抗性糊精和分離乳清蛋白對蘋果汁中的植物乳桿菌CCFM8661均有保護效果?？赡芤驗槎咚鶖y帶的氨基、羧基以及羥基可以與菌體細胞膜表面的磷脂基團或蛋白質極性基團形成氫鍵，降低氫離子對菌體細胞的損傷。但在貯藏期第21天，發酵蘋果汁添加分離乳清蛋白組植物乳桿菌CCFM8661的存活率降至(15±2.8)%，抗性糊精組降至(20±2.0)%(圖4)。 雖然相較于空白對照組均有提高，但是植物乳桿菌的活性損失超過了80%，還需要進一步提高其活性保持。

圖4 保護劑對發酵蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661貯藏期存活率的影響Fig.4 Effect of protectant on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

2.6 微膠囊對發酵蘋果汁中植物乳桿菌活性保持的影響

將植物乳桿菌CCFM8661與保護劑混合后以1%海藻酸鈉制備微膠囊進行包埋，將其至于發酵蘋果汁。結果表明，經微膠囊化后可顯著提高植物乳桿菌CCFM8661在發酵蘋果汁貯藏期間的存活率(圖5)。

WPI-W-100 g/L分離乳清蛋白作保護劑，1%海藻酸鈉進行微囊化； K-空白對照組； RD-W-100 g/L抗性糊精作保護劑，1%海藻酸鈉進行微囊化圖5 微膠囊化對植物乳桿菌CCFM8661在發酵蘋果汁貯藏期存活率的影響Fig.5 Effect of microencapsulation on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

以分離乳清蛋白做保護劑對菌體進行的微膠囊包埋，貯藏21 d植物乳桿菌CCFM8661存活率達(27±1.8)%，高于未包埋的實驗組。以抗性糊精作保護劑對菌體微膠囊包埋后，貯藏21 d植物乳桿菌CCFM8661的存活率得到更顯著的提高，達到(50±1.4)%。海藻酸鈉形成的微膠囊減緩了H+的侵入，微膠囊內保護劑不僅對菌體細胞有保護作用，且起到了緩沖作用，更好地延緩了植物乳桿菌CCFM8661活性的損失?；谏鲜龇治?，增加保護劑濃度或增加微膠囊粒徑提高微膠囊內保護劑對H+的緩沖能力是否會進一步提高植物乳桿菌CCFM8661在貯藏期的存活率，需要進一步驗證。

2.7 不同濃度保護劑制備的微膠囊對發酵蘋果汁植物乳桿菌活性保持的影響

根據圖5和圖6可知，適量增加抗性糊精的濃度會提高植物乳桿菌CCFM8661在發酵蘋果汁中的貯藏存活率。在圖5中，10%抗性糊精制備的微膠囊在發酵蘋果汁中貯藏21 d后，植物乳桿菌CCFM8661存活率為(50±1.4)%。由圖6可知，提高抗性糊精質量濃度至200 g/L，制備的微膠囊在貯藏21 d時植物乳桿菌CCFM8661的存活率達(78±3.6)%，優于100 g/L的保護效果。但是，繼續增加抗性糊精的質量濃度至300 g/L時，保護效果會下降，可能是因為滲透壓的升高影響了菌體的活性，但是300 g/L的抗性糊精組依然優于100 g/L的實驗組。綜上，適當提高微膠囊內保護劑的濃度可提高其對菌體在發酵蘋果汁貯藏期的活性保持，但濃度應適宜，濃度太高會影響保護效果。

圖6 不同濃度保護劑制備的微膠囊對植物乳桿菌CCFM8661在發酵蘋果汁貯藏期存活率的影響Fig.6 Effect of microcapsules prepared with different concentrations of protectant on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

2.8 微膠囊粒徑對發酵蘋果汁植物乳桿菌活性保持的影響

由圖7知，以200 g/L抗性糊精做保護劑，制備直徑4 mm的微膠囊，其提高了植物乳桿菌CCFM8661在發酵蘋果汁中的貯藏存活率，貯藏21 d后存活率達(81±3.1)%；且在整個貯藏期內，4 mm粒徑的實驗組菌體存活率普遍高于2 mm實驗組。說明適當增加粒徑對植物乳桿菌CCFM8661在整個貨架期內的活性保持有積極作用。亦驗證了2.6中的推測，隨著粒徑增大，微膠囊內保護劑的量增加，提高了其對菌體的保護作用。

圖7 微膠囊粒徑對植物乳桿菌CCFM8661在發酵蘋果汁貯藏期存活率的影響Fig.7 Effect of microcapsule size on survival rate of of Lctobacillus plantarum CCFM8661 in fermented apple juice during storage

2.9 發酵及保護劑添加對蘋果汁風味物質的影響

根據表1，蘋果汁經植物乳桿菌CCFM8661發酵后風味得到顯著改善，具有辛辣氣味的丙酮、窒息性氣味的丁醛、令人不愉悅氣味的三氯甲烷、苯酚等不好的風味物質在發酵后含量明顯降低；而具有果香味、堅果香味、芳香味等香味的庚酮、苯甲醛、2-十一酮、嘧啶等，及對人體健康有益的乙酸、丁酸、癸烯酸等經發酵后顯著提高。且發酵后添加抗性糊精作為保護劑，并未對發酵蘋果汁的風味物質產生顯著影響。

表1 蘋果汁的風味物質Table 1 The falavor of apple juice

3 結論

(1)蘋果汁中缺乏適宜乳酸菌增殖的氮源和微量元素，且pH值太低，植物乳桿菌CCFM8661無法在蘋果汁中快速生長。

(2)蘋果汁中添加5 g/L K2HPO4和7 g/L檸檬酸鈉，可調整蘋果汁pH值至5.5，基于此添加5 g/L酵母粉和適量微量元素錳，可顯著促進植物乳桿菌CCFM8661在蘋果汁中的增殖。發酵12 h后，蘋果汁中植物乳桿菌CCFM8661的活菌數達(3.4±0.2)×109CFU/mL。

(3)發酵蘋果汁中添加分離乳清蛋白或抗性糊精均會提高植物乳桿菌CCFM8661在4 ℃貯藏期的活性保持，且抗性糊精效果優于分離乳清蛋白，且抗性糊精的添加不會對發酵蘋果汁風味產生影響。

(4)以分離乳清蛋白作為保護劑，以海藻酸鈉為壁材，包埋菌體與保護劑的混合液制備微膠囊，可顯著提高植物乳桿菌CCFM8661在發酵果汁中儲藏期間的存活率。

(5)微膠囊內保護劑的濃度和微膠囊粒徑大小均會影響其對植物乳桿菌CCFM8661在發酵蘋果汁貯藏期的存活率，適當增加保護劑濃度和粒徑大小會進一步提高微膠囊的保護效果。