SMC蛋白結構和功能的研究進展

計文 陶權丹 王時超 華杰 劉康偉 張建祥 于梅梅 于恒秀

摘要：染色體不僅僅由DNA構成，還包含一些使染色體能具有特定形態特征以及在基因表達和基因組穩定性中起作用的蛋白。而使染色體能具有特定形態特征的首要物質就是染色體結構維持蛋白（structural maintenance of chromosomes，SMC）復合體。SMC復合體包含凝聚蛋白（condensin）、黏結蛋白（cohesin）和SMC5-SMC6復合體，是染色體的重要組分。SMC蛋白的表達依賴于ATP的水解以及DNA的拓撲作用。SMC復合體參與了多重染色體行為，其中尤為顯著的是染色體集縮和姐妹染色單體的黏著。此外，SMC復合體在DNA修復中也有重要的作用。近年來，隨著分子生物學研究技術的發展，對該類復合體的結構、功能及作用機制等方面已有較多研究并取得一些重要進展，本文對SMC蛋白結構和功能的研究進展做一綜述。

關鍵詞：染色體結構維持蛋白;凝聚蛋白;黏結蛋白;SMC5-SMC6復合體

中圖分類號： S188? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0032-05

構成有機體染色體組分的DNA分子通常來說比有機體本身還要長，例如在一個人類細胞中大約有4 m長的DNA。在細胞分裂的準備過程中，DNA被進一步壓縮而使有絲分裂時期染色體出現一定形態特征。但DNA是如何被包裹在細胞這樣小的結構中的，目前尚不清楚。染色體不僅僅由DNA構成，還包含一些在基因表達和基因組穩定性中起作用的蛋白。而使染色體能具有特定形態特征的首要物質就是染色體結構維持蛋白（structural maintenance of chromosomes，SMC）復合體，這使得SMC蛋白結構和功能的研究具有重要意義。

本文重點關注SMC復合物在染色體集縮、姐妹染色單體黏著以及DNA修復中的功能。

1 SMC蛋白研究簡史

1991年NiKi等首次在大腸桿菌mukB突變體中發現了1個參與染色體分離的SMC蛋白家族成員MUKB[1]。MUKB是第一個被發現編碼SMC蛋白的基因。1993年，Strunnikov等克隆了1個能夠維持微染色體穩定性的芽殖酵母基因，并命名為SMC1，由此發現了具有相似結構的蛋白質SMC1[2]（圖1）。之后在多種生物體的基因組中發現了類似的編碼SMC1蛋白的基因，如裂殖酵母中的2個編碼SMC蛋白的基因cut3+和cut14+，在兩者的突變體中均觀察到染色體的凝聚和分離發生異常[3]。

同一時期內，對脊椎動物染色體的生化分析也發現了相似的蛋白質。在非洲爪蟾的卵子提取試驗中發現2個染色體相關蛋白XCAPC和XCAPE（Xenopus chromosome-associated polypeptide），也被稱為SMC2和SMC4。SMC2/SMC4復合體在染色體集縮時發揮作用[4]。在雞細胞的染色體中發現了一種135 ku的蛋白質ScⅡ（也稱作SMC2），是XCAPE的同源蛋白[5]。此外，在芽殖酵母smc2突變體中發現染色體集縮行為的缺失[6]。

在研究早期人們就認識到SMC蛋白的功能不僅僅涉及染色體形態以及分離。秀麗隱桿線蟲性染色體劑量補償的研究表明，編碼SMC蛋白的dpy-27基因突變會導致胚胎中的X染色體不能下調基因表達[7]。此外，裂殖酵母中的輻射敏感蛋白RAD18，被證實是SMC蛋白的一個獨特亞組，現在稱作SMC5和SMC6[8]。

真核生物中SMC蛋白兩兩之間會形成3種異二聚體：以SMC2-SMC4為核心形成凝聚蛋白（condensin）復合體[9]、以SMC1-SMC3為核心形成黏結蛋白（cohesin）復合體、SMC5-SMC6則是多亞基DNA修復復合物的基礎結構。這3種復合物對真核生物來說都是必需的，它們在部分功能上存在重疊，如黏結蛋白參與染色體集縮，黏結蛋白和凝聚蛋白均在DNA修復中發揮作用[10]。

黏結蛋白復合體能夠介導姐妹染色單體的黏著，這一發現揭示了SMC復合體在真核生物染色體分離中起到重要功能。姐妹染色單體產生于S期，通過黏結蛋白維系在一起直到有絲分裂期[11]。黏結蛋白使得姐妹染色單體能夠進行識別配對，并且在紡錘絲的牽引下在赤道板2側進行排列。SCC1（sister chromatid cohesion 1）亞基水解使得黏結蛋白從染色體上脫離，從而誘發有絲分裂后期的開始[12-14]。以上這些功能以及它們在整個細胞周期中的其他許多作用，確立了SMC復合體在生物學中的重要地位。

2 SMC蛋白及其復合體的基本結構

SMC蛋白在進化上是保守的，從細菌到人體中的SMC蛋白都具有相似的基本結構，含有5個不同的結構域（圖1）。SMC蛋白由1 000～1 400個氨基酸組成，其N-端結構域（約含160個氨基酸）和C-末端結構域（約含150個氨基酸）高度保守，分別含有Walker A和Walker B結構域，中間是中度保守的非螺旋的“鉸鏈”（hinge）結構域，由2個長的卷曲螺旋分別與N端和C端連接，這2個長的卷曲螺旋也被稱為SMC蛋白的2條臂[15]。

SMC蛋白復合體包含SMC蛋白二聚體、1種Kleisin蛋白以及2種HEAT蛋白。首先由單個SMC分子以分子中央的絞鏈（Hinge）區為中點自折疊，絞鏈區2側的長螺旋（coiled-coil）區相互絞結形成長臂，N、C末端相互結合形成ATP酶區的頭部;自折疊的2個分子通過絞鏈區相互結合，另一端的2個ATP酶區頭部與非SMC蛋白亞基結合，從而形成了一個環形或“V”字形的獨特結構。在原核生物中，由一種SMC同源蛋白形成同二聚體，再結合2個Kleisin同源蛋白ScpA與2個ScpB蛋白，形成唯一的一種復合體[16]。在真核生物中，以SMC1-SMC3異二聚體為核心結合Kleisin蛋白（Scc1）和HEAT重復蛋白（Scc3、Psd5）構成黏結蛋白復合體（脊椎動物中SMC1有2個亞型：SMC1α和SMC1β，可形成2種黏結蛋白復合體，分別在有絲分裂和減數分裂中行使功能[17]）;以SMC2-SMC4異二聚體為核心結合特異的Kleisin蛋白和HEAT蛋白，形成凝聚蛋白復合體，且根據結合的非SMC蛋白的不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型復合體[18];以SMC5-SMC6異二聚體為核心結合Nse蛋白（Nse1-Nse6）則形成第三類復合體——SMC5-SMC6復合體[19]。

SMC二聚體的結構在絕大多數情況下是對稱的，但在黏結蛋白以及細菌的SMC復合體中觀察到Kleisin蛋白與SMC頭部存在非對稱結合。Kleisin蛋白的N末端形成螺旋結構與其中一個SMC蛋白的頭部結合;C末端則附著到另一個SMC蛋白頭部[20-22]。HEAT重復蛋白則是聚集在Kleisin的周圍，目前已知HEAT能夠與鉸鏈區互作。表1列出了真核生物SMC復合體的主要結構組分。

標注的蛋白是凝聚蛋白Ⅱ的組分。SA1、SA2以及PDS5A、PDS5B是黏結蛋白的組分。Sororin Ⅱ僅存在于后生動物黏結蛋白中。

已有的研究表明，SMC復合體與DNA分子的相互作用最可能的模式是環抱模型（embrace model;the ring model），該模型認為黏結蛋白通過拓撲環繞結合到DNA。黏結蛋白在細胞內拓撲環繞到微染色體（minichromosomes），而在體外黏結蛋白依賴于ATP水解從而加載到DNA上[23-24]。與之相似，凝聚蛋白和SMC5-SMC6復合體在體內也是與微染色體進行拓撲結合，而細菌的SMC復合體是與其環形染色體進行拓撲性結合[25-27]。拓撲結構曾被認為對于SMC復合物功能的發揮至關重要。黏結蛋白完整的環形結構能夠維持姐妹染色單體的黏著，在細胞分裂后期Scc1的脫離使得環形結構打開。凝聚蛋白完整的拓撲結構能夠參與芽殖酵母染色體的分離。拓撲模型能夠很好地解釋SMC復合物在染色體中的功能。但也有試驗表明，復合體中的蛋白分子能夠與DNA鏈直接相互作用。SMC分子的ATP頭部區域可以與DNA鏈直接結合，一個復合體的2個SMC分子頭部分別結合2條DNA鏈從而將姊妹染色質的2條鏈或者同一染色質不同區段的2段DNA拉在一起[28]。但是這2種模型均未能解釋SMC復合體是通過單個復合物分子行使作用 還是通過2個或多個復合物分子之間相互聚合來行使功能。

3 黏結蛋白的生物學特征與功能

黏結蛋白復合體最早發現于酵母細胞，該蛋白復合體含有4個亞基：即1對SMC蛋白Smc1、Smc3以及2個非SMC蛋白Rad21/Scc1和Scc3/SA構成，SA蛋白在脊椎動物體細胞中又分為SA1以及SA2這2類。其中2個SMC蛋白形成1個反向二聚體，該二聚體的起始域與Rad21蛋白互作，完成封閉環結構，Rad21再與SA結合，從而形成了完整的黏結蛋白復合體[29]（圖2）。黏結蛋白復合體參與姐妹染色單體的黏著、DNA修復以及細胞周期中檢查點（checkpoint）的活化。

黏結蛋白在G1期加載到染色質上，Scc2和Scc4組成的蛋白復合體作為加載因子，在S期參與姐妹染色單體的黏著，對M期染色體的正確分離也有重要的作用[30]。黏結蛋白黏著力的形成需要激活“形成因子”（establishment factor）Eco1。絕大多數的黏結蛋白、相關蛋白（Wapl、Pds5等）以及加載因子（Scc2/Scc4）都在細胞分裂前期時從染色體臂上被移除，其余附著在著絲粒上的黏結蛋白在后期被去除。黏結蛋白復合體可以有效防止姐妹染色單體的提前分離，因而在維持染色體穩定性方面具有重要意義。黏結蛋白在細胞分裂過程中的機制尚不明了，但普遍認為其功能的發揮依賴于多個相關蛋白的協調作用。

關于黏結蛋白維持染色質穩定的機制，研究者主要提出了3種模型：單環模型（one ring model）、雙環模型（two ring model）以及多桿狀模型（multimeric rod-shaped model）[31]。單環模型認為，黏結蛋白將2個10 nm長的姐妹染色單體纖維捕獲在1個三角形的環形結構中;雙環模型提出，1個黏結蛋白環繞1條姐妹染色單體，在DNA復制時通過Irr1/Scc3將2個環聯結在一起[32];桿狀結構是由多個黏結蛋白分子之間相互作用形成，SMC在桿狀結構的其中一端，而姐妹染色單體處于另一端[33]。

在人類細胞以及酵母細胞中，黏結蛋白復合體依賴H2A磷酸化富集在DNA雙鏈斷裂（DSB）位點附近[34]。H2AX對于DNA修復蛋白的聚集以及穩定性具有很重要的作用。隨后，其他的DNA損傷調控子，比如MDC1以及53BP1被招募到損傷位點，進一步增強DNA損傷信號[35]。發生DNA損傷后，SMC1和SMC3通過ATM進行磷酸化，細胞的存活率降低并且染色體畸形率升高。同時SMC1和SMC3磷酸化會導致S期及G2/M期檢查點功能缺失[36]，有研究者提出，與黏結蛋白在DNA修復中的功能不同，它們對于檢查點的作用獨立于黏結蛋白自身擁有的黏著屬性[36]。而SMC1和SMC3只有作為黏結蛋白復合體的亞基時，它們才能夠進行磷酸化。

4 凝聚蛋白的結構與功能

大多數的真核生物具有2種凝聚蛋白，凝聚蛋白Ⅰ和凝聚蛋白Ⅱ，而原核生物和古細菌只表達一種SMC蛋白，具有原始形式的凝聚蛋白。在芽殖酵母和裂殖酵母中只發現了凝聚蛋白Ⅰ。果蠅中存在2種凝聚蛋白，但是果蠅的凝聚蛋白Ⅱ中缺少CAP-G2亞基。目前為止尚未發現只擁有凝聚蛋白Ⅱ的生物。

在真核生物中，以SMC2-SMC4異源二聚體為核心與3種非SMC蛋白一起構成5個亞基的凝聚蛋白復合物，集縮素在有絲分裂染色體集縮中發揮重要作用[3]（圖3）。

凝聚蛋白最早發現于蟾蜍卵提取物中，免疫試驗證明在無細胞系統（cell-free system）中該蛋白復合物是染色體集縮必需的活性復合物，因此也被稱為集縮蛋白，其核心組分是SMC2和SMC4蛋白。目前已有充足的證據表明凝聚蛋白參與染色體集縮。

爪蟾的凝聚蛋白復合體含有2個SMC家族蛋白，XCAP-C 以及XCAP-E，另外還有3個非SMC蛋白XCAP-D2、XCAP-G 和 XCAP-H[37]。 將爪蟾精子DNA添加到爪蟾卵細胞提取物中，精子DNA能裝配成集縮的有絲分裂染色體。如果爪蟾卵細胞中凝聚蛋白發生異?；蛉笔?，那么染色體會解集縮。因此凝聚蛋白不僅參與染色體的集縮，同時也在集縮狀態維持方面發揮功能。

芽殖酵母和裂殖酵母中的凝聚蛋白亞基十分保守，是細胞存活的必需物質，如果其中凝聚蛋白亞基發生突變，染色體不能正常集縮，這些異常細胞在核分裂之前完成細胞質的分裂，有絲分裂細胞從而被一分為二。在這種細胞中觀察到團在一起的DNA，即染色體不能正常分開。酵母的原位雜交試驗發現，SMC蛋白亞基突變體中有絲分裂染色體不能實現正常的集縮狀態[37]。近年來有研究發現，裂殖酵母核仁蛋白Dnt1通過調控凝聚蛋白實現抑制姐妹染色體的錯誤分離。為了保證姐妹染色體的對稱分離，每條姐妹染色體的動粒體必須與分別來自兩極的相同數量的紡錘體微管連接，而當1條姐妹染色單體同時與兩極的紡錘體微管連接時，稱這種現象為“merotelic attachment”。在酵母dnt1突變體中，染色體凝聚蛋白復合體組分Cut14的蛋白水平下降，而著絲粒區的凝聚蛋白也會主動抑制姐妹染色體的“merotelic attachment”。因而研究人員推測核仁蛋白Dnt1可能是通過調控位于著絲粒區的凝聚蛋白來抑制姐妹染色體的“merotelic attachment”，從而保證姐妹染色體的對稱分離[38]。

線蟲中Smc2型蛋白MIX-1純合突變體的第2代中100%表現為胚胎致死，這些胚胎發生各種染色體畸變，最普遍的是在分裂后期出現染色體橋的現象。果蠅中凝聚蛋白的亞基蛋白DmSmc4發生突變后，大部分細胞在分裂后期或末期出現染色體橋[39]。在雞DT40細胞中敲除凝聚蛋白亞基ScⅡ/Smc2之后，有絲分裂中染色體的集縮發生滯后，即使在中期可恢復成正常水平，但卻破壞了染色體的結構完整性。

在植物中也發現存在SMC蛋白，在擬南芥中有2個編碼SMC2型蛋白的基因AtCAP-E1和AtCAP-E2，這2個基因在功能上存在重復[40]。Liu等利用擬南芥種子發育過程中出現有絲分裂阻斷現象的突變體，從中鑒定出titan突變體，并且發現了編碼AtCAP-E1的TTN3。研究者推測titan突變體中出現的核仁異常增大現象可能是由凝聚蛋白功能的缺失引起的。在另外的研究中發現AtCAP-E1能夠與酵母的 Smc2-Δ6突變體實現功能互補。這些試驗均表明AtCAP-E1參與了擬南芥中染色體的集縮。

5 SMC5-SMC6復合體

SMC5-SMC6構成的復合體是真核生物必需的SMC復合體成員之一。因為能夠促使重組中間體的分離，所以SMC5-SMC6在DNA修復方面有著突出的作用。SMC5-SMC6復合體最初在裂殖酵母以及芽殖酵母SMC6同系物的分離試驗中被發現，分別是RAD18以及RHC18。之后在人類細胞中被定義為SMC5以及SMC6。目前SMC5-SMC6復合體在生物體中真正必要的功能尚不清楚。最近的研究發現，SMC5-SMC6復合體在有絲分裂的G2期具有重要功能[41]。有觀點認為 SMC5-SMC6復合體的缺失會導致復制后期發生異常[42]。SMC5-SMC6復合體也在DNA的拓撲結構中發揮作用[43]。

SMC5-SMC6復合體與黏結蛋白及凝聚蛋白有著相似的結構，擁有一個SMC二聚體，同時與kleisin緊密相連。其HEAT重復亞基Nse5和Nse6在芽殖酵母中是必需的，但在裂殖酵母中卻可有可無。與前2種SMC復合體不同的是，SMC5-SMC6的kleisin蛋白還與Nse1及Nse3構成的二聚體聯結，這種結構與原核生物SMC復合體亞基MukE和ScpB中二聚體的構造十分相似（圖4）[44]。這表明原核生物SMC復合體與真核生物SMC5-SMC6復合體之間可能具有相似的功能。Nse3亞基能夠連接到DNA從而促使SMC5-SMC6復合體加載到染色體上[45]。SMC5-SMC6還有個獨特的特征，其Nse2擁有一個叫做SUMO連接酶的亞基，該亞基作用于SMC5的鉸鏈區（coiled-coil），但SUMO連接酶的活性對于SMC5-SMC6復合體功能的發揮而言并非必要。與之相似，Nse1是復合體的必需結構，但是Nse1的亞基泛素連接酶是否活化對于復合體并無影響[46]。SUMO以及泛素連接酶的活化可以響應外源的DNA損傷。目前已經證實DNA修復時需要大量的泛素作為底物。

DSB可以發生于DNA復制期，或者暴露在造成DNA損傷的因素下。DSB的正確修復是細胞存活以及基因組穩定性的基礎。真核生物細胞主要有2種DSB修復機制：NHEJ（non-homologous end-joining）和HR（homologous recombination）。NHEJ途徑是將斷裂的DNA末端直接重新連接，而HR先要搜索到相似的序列，以此作為模板來修復斷裂位點。在酵母以及哺乳動物細胞中，同源重組優先使用完整的姐妹染色單體作為DSB修復模板。DNA損傷的檢測可以活化DNA修復路徑以及檢查點，以此來為修復爭取到充足的時間。這些損傷響應必須相互協同來確保細胞周期的暫停，直到修復完成[47]。

SMC5-SMC6復合體可以被招募到DSB位點，從而參與同源重組修復[48]。SMC5-SMC6突變體中各種DNA損傷的修復過程都會出現異常。正常細胞中只有很少的SMC6結合到染色質上，而一旦DSB產生，斷裂位點附近區域結合的SMC6數目有顯著提升。除了SMC5-SMC6復合體，黏結蛋白和凝聚蛋白也會響應DNA損傷。黏結蛋白和SMC5-SMC6聚集在DSB位點作為DNA損傷響應的一部分[49-51]。

最近的研究表明，SMC5-SMC6復合體在減數分裂過程中也有一定的功能。減數分裂中的重組事件需要SMC5-SMC6復合體的參與。當減數分裂重組中間體不能正常地形成交叉或非交叉時，會出現異常的聯結分子結構（joint molecules，JMs），這些JMs有可能會阻礙染色體分離[52]。RecQ家族的DNA解旋酶Sgs1能夠限制JM結構的形成，結構選擇性核酸酶Mus81-Mms4、Slx1-Slx4以及Yen1也可以參與消除JMs。在芽殖酵母中，SMC5-SMC6復合體通過2種機制來抵消JMs的影響：通過破壞SEI（Single End Invasions）中間體的穩定來預防JMs的產生;促進JM的分解[53]。