丹參酮分別聯合伊曲康唑、特比萘芬對紅色毛癬菌體外抗菌活性研究Δ

王 丹，于淑萍，吳景良，齊?；?，段昕所

(1.無錫市第三人民醫院整形美容科，江蘇 無錫 214000； 2.承德醫學院附屬醫院皮膚性病科，河北 承德 067000)

真菌性皮膚病是由皮膚癬菌感染，其中紅色毛癬菌是常見皮膚癬菌。近年來，紅色毛癬菌病的發病率逐年升高，因其治愈效果較差，病死率也呈不斷升高趨勢；由于紅色毛癬菌隱藏較為隱蔽，所致疾病的病程較長，不僅難以治愈，還容易反復發作及再感染，若未及時救治，甚至可引發丹毒、淋巴管炎及感染中毒性休克等并發癥，降低患者生活質量[1]。目前，臨床主要采用丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬等抗真菌藥治療紅色毛癬菌感染，但不同藥物對紅色毛癬菌的敏感性存在差異性。同時，因臨床用藥時間過長導致耐藥菌株顯著增加，故多應用聯合治療以減少耐藥性，提高治療效果[2-3]?；诖?，本研究收集紅色毛癬菌并應用丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬進行體外藥物敏感試驗，觀察丹參酮對紅色毛癬菌超微結構的影響，以期為臨床治療提供可靠實驗室依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取臨床分離紅色毛癬菌40株進行體外藥物敏感試驗，菌株來自體股癬、甲真菌病，經常規組織分離并進行形態學鑒定。男性患者17例，女性患者23例；年齡4～65歲，平均(45.32±5.94)歲；直接鏡檢：陽性20例，陰性20例；部位：趾甲28例，指甲8例，其他部位4例；耐35 ℃高溫試驗：耐高溫24株，不耐高溫16株；色素試驗：產紅色素23株，未產色素17株。

1.2 方法

參照美國臨床和實驗室標準化研究所(clinical and laboratory standards institute，CLSI)M38-A2方案，檢測丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對紅色毛癬菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并采用分級抑制濃度指數(factional inhibitory concentration index，FIC)評價丹參酮聯合伊曲康唑、特比萘芬效果。

1.3 藥品配制

丹參酮(美國Acros Organics公司，純度99%)，終質量濃度為0.250 0～128.000 0 μg/ml。伊曲康唑(比利時楊森制藥公司，批號：7073402)，終質量濃度為0.031 2～16.000 0 μg/ml。特比萘芬(中國藥品生物制品檢定所，批號：100563-200301)，終質量濃度為0.031 2～16.000 0 μg/ml。采用沙氏葡萄糖蛋白胨液體培養基倍比稀釋，將其倍比稀釋為由高至低8個濃度的含藥培養液備用。

1.4 菌懸液的制備

紅色毛癬菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上進行活化并純化，并加入無菌0.85%氯化鈉溶液l ml制備菌懸液，后使用巴氏吸管將菌懸液置入無菌試管中，加入1粒無菌玻璃珠在振蕩器上振蕩2 min，靜置后取上部勻質液體再次振蕩15 s。采用細胞計數板計數，用RPMI 1640液調節菌懸液濃度為(2～6)×105CFU/ml備用。再使用RPMI 1640液稀釋50倍進行接種，菌懸液最終濃度為(2～6)×103CFU/ml。

1.5 試驗過程

1.5.1 丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬單獨藥物敏感試驗：通過移液器提取丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬的倍比稀釋液100 μl，依次加入96孔板第1—10列孔，加入2倍終濃度菌懸液100 μl，第11列孔加入2倍終濃度菌懸液100 μl、RPMI 1640液體培養基100 μl作為陽性對照，第12列孔加入RPMI 1640液體培養基200 μl、不加菌懸液為陰性對照，28 ℃恒溫培養，5～7 d后待陽性對照生長良好(肉眼檢查出現80%以上生長抑制)進行MIC結果判定。

1.5.2 丹參酮聯合伊曲康唑、特比萘芬的藥物敏感試驗：采用棋盤微量稀釋法，使用微量移液器將藥物加入96孔板第1—10列孔，按照從高到低濃度依次加入丹參酮倍比稀釋藥液各50 μl和伊曲康唑、特比萘芬倍比稀釋液各50 μl，再加入2倍終濃度菌懸液100 μl，第11列孔加入RPMI 1640液體培養基100 μl、2倍終濃度菌懸液100 μl；第12列孔加入RPMI 1640液體培養基200 μl。28 ℃恒溫培養，5～7 d后進行FIC結果判定，其中FIC<1為協同作用，1≤FIC<2為無關作用，FIC≥2為拮抗作用。

1.6 質量控制

每株菌株均重復實驗3次，并進行質控、參考菌株檢測，質控菌株為近平滑念珠菌ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC6258。結果均由2名經驗豐富的醫師共同判讀，意見不一致時可共同討論決定。

1.7 紅色毛癬菌電鏡標本制備

2倍終濃度菌懸液100 μl分別由高濃度到低濃度加入96孔板第1—10列孔中，第11列孔僅加紅色毛癬菌菌懸液為生長對照，第11、12列孔紅色毛癬菌菌懸液與藥物均不加為空白對照。將上述菌懸液100 μl分別加入各孔內，并將菌懸液與抗真菌藥物(丹參酮和伊曲康唑、特比萘芬的倍比稀釋液)分別以1∶1稀釋至終濃度。于26 ℃環境下孵育，7 d進行常規脫水、包埋即染色等，制備成電鏡樣品，另選取正常紅色毛癬菌作為對照，采用掃描電鏡與透射電鏡觀察紅色毛癬菌菌絲外觀形態、細胞膜、細胞壁及細胞核等超微結構變化情況。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，單獨抗真菌藥物的MIC比較采用多樣本比較的Kruskal-wallis H檢驗，兩兩比較采用秩轉換后單因素方差分析，丹參酮聯合伊曲康唑、特比萘芬抗菌FIC采用精確概率法χ2檢驗，均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對紅色毛癬菌的MIC比較

丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對紅色毛癬菌MIC的差異有統計學意義(P<0.05)，其中伊曲康唑MIC較低，丹參酮MIC較高，見表1。

2.2 丹參酮聯合不同質量濃度伊曲康唑的FIC比較

丹參酮僅聯合0.031 2、0.062 5 μg/ml的伊曲康唑時，FIC<1所占比例分別為42.50%(17/40)、45.00%(18/40)，以協同作用為主；而聯合其他質量濃度的伊曲康唑時以拮抗作用為主，不同質量濃度組間比較的差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對紅色毛癬菌MIC結果 比較(n=40)Tab 1 Comparison of MIC results among tanshinone, itraconazole and terbinafine against trichophyton rubrum (n=40)

表2 丹參酮聯合不同質量濃度伊曲康唑的FIC比較(n=40)Tab 2 Comparison of FIC results among tanshinone combined with different concentrations of itraconazole (n=40)

2.3 丹參酮聯合不同質量濃度特比萘芬的FIC比較

丹參酮聯合不同質量濃度的特比萘芬時均以拮抗作用為主，不同質量濃度組間比較的差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 丹參酮聯合不同質量濃度特比萘芬的FIC比較(n=40)Tab 3 Comparison of FIC results among tanshinone combined with different concentrations of terbinafine (n=40)

2.4 丹參酮對紅色毛癬菌掃描電鏡及透射電鏡結果

掃描電鏡下觀察，正常紅色毛癬菌菌絲細胞壁完整，質地致密，細胞基質均勻，可見細胞核、線粒體等超微結構，見圖1。掃描電鏡下觀察，250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌72 h后，菌絲形態發生明顯改變，表面變粗糙，現破壞性裂縫，并出現多處斷裂，見圖2。掃描電鏡下觀察，62.5 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌72 h后，菌絲形態未發生明顯變化，僅見較小破壞性孔洞，且菌絲粗細均勻，見圖3。透射電鏡下觀察，250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌72 h后，細胞變形明顯，細胞壁粗糙，厚薄不均，細胞漿結構模糊，細胞核破碎，改變紅色毛癬菌超微結構，見圖4。

圖1 正常紅色毛癬菌的掃描電鏡圖Fig 1 Scanning electron microscopy of normal trichophyton rubrum

圖2 250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌的掃描電鏡圖Fig 2 Scanning electron microscope of 250 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

圖3 62.5 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌的掃描電鏡圖Fig 3 Scanning electron microscope of 62.5 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

圖4 250 μg/ml丹參酮作用于紅色毛癬菌的透射電鏡圖Fig 4 Transmission electron microscopy of 250 μg/ml of tanshinone acts on trichophyton rubrum

3 討論

臨床將真菌性皮膚病分為淺部真菌病及深部真菌病，紅色毛癬菌作為淺部真菌病主要致病菌，可引發手足癬、頭癬及甲癬等，臨床多表現為不同程度瘙癢、疼痛及功能性障礙等癥狀，而紅色毛癬菌發病與菌株類型、免疫因素等存在密切聯系[4-6]。隨著臨床對真菌感染研究的不斷深入，抗真菌藥的發展取得卓越成就，并具有良好的治療效果，但因其廣泛應用，真菌耐藥現象也日益增多，引發多種不良反應，患者依從性較差[7-8]。因此，選取高效、廣譜且低毒的抗真菌藥成為治療紅色毛癬菌病的關鍵。

丹參為臨床治療常用中草藥，其中丹參酮為主要有效成分之一，并包括丹參酮 Ⅰ、丹參酮 ⅡA及異丹參酮等十余種單體，具有清除氧自由基、抑制炎癥細胞增殖、殺傷腫瘤細胞及抑制血管平滑肌細胞增殖等作用[9-10]。臨床研究結果顯示，丹參酮對銅綠假單胞菌具有較強體外抑菌作用；而對紅色毛癬菌進行體外藥物敏感試驗發現，聯合用藥可發揮各種藥物的不同作用機制，具有較強協同作用[11-12]。但目前關于丹參酮用于紅色毛癬菌的臨床研究較少，也未能明確單一用藥或聯合抗真菌藥的效果；其中伊曲康唑、特比萘芬是治療真菌感染常用的系統性抗真菌藥，經證實兩者對紅色毛癬菌所致肉芽腫可發揮良好治療作用[13-14]。故本研究探討了丹參酮聯合伊曲康唑、特比萘芬的抑菌作用，從而為臨床治療提供科學依據。

因影響MIC測定的因素較多，當前皮膚癬菌藥物敏感試驗標準尚未統一，本研究參照的M38-A2方案(CLSI制定)經胡小平等[15]研究結果證明其重復性及穩定性較好，可指導用藥并監控耐藥菌株發生。本研究結果顯示，丹參酮、伊曲康唑及特比萘芬對紅色毛癬菌MIC的差異有統計學意義(P<0.05)，其中伊曲康唑MIC較低，丹參酮MIC較高。表明丹參酮對紅色毛癬菌的抗菌作用較弱，需聯合其他有效抗真菌藥提高治療效果。丹參酮僅聯合0.031 2、0.062 5 μg/ml的伊曲康唑時，FIC<1所占比例分別為42.50%(17/40)、45.00%(18/40)，以協同作用為主；而聯合其他質量濃度的伊曲康唑時以拮抗作用為主，不同質量濃度組間比較的差異均有統計學意義(P<0.05)；丹參酮聯合不同質量濃度的特比萘芬時均以拮抗作用為主，不同質量濃度組間比較的差異均有統計學意義(P<0.05)。提示丹參酮聯合伊曲康唑、特比萘芬具有較強拮抗作用，在紅色毛癬菌病治療過程中不能在應用丹參酮同時聯合伊曲康唑、特比萘芬治療，以減少不良反應，避免抗菌藥物濫用。應用電鏡觀察丹參酮對紅色毛癬菌形態學影響，研究結果顯示，250 μg/ml丹參酮對紅色毛癬菌具有較強破壞性，而62.5 μg/ml丹參酮對紅色毛癬菌破壞性明顯降低。提示丹參酮破壞紅色毛癬菌的細胞壁、細胞膜，胞內細胞器受損更為嚴重，增加真菌通透性，從而發揮較強抗菌作用，且不同濃度的丹參酮對紅色毛癬菌作用效果存在差異性，對于其具體作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，丹參酮對紅色毛癬菌具有一定抑制作用，隨著濃度增加而抑菌作用增強。丹參酮分別聯合伊曲康唑、特比萘芬對紅色毛癬菌均以拮抗作用為主，故應避免聯合應用。而丹參酮可使紅色毛癬菌超微結構發生明顯改變，進而發揮有效抗真菌作用。本研究為臨床治療因紅色毛癬菌引起的真菌性皮膚病提供了實驗室依據，但因所實施的體外藥物敏感試驗是在參考CLSI M38-A2方案與相關文獻基礎上進行的，理論性較強，難以反映機體實際情況，結果存在不足，對此應在大量樣本基礎上進行多中心加強驗證，為臨床治療紅色毛癬菌感染提供用藥參考。