一測多評法比較不同生產廠家復方丹參片中丹參酮類成分的含量

高 奇王海燕周 偉呂寶興李玉琴

1.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學院，山東泰安 271016；2.泰安市食品藥品檢驗檢測研究院，山東泰安 271099

復方丹參片由丹參、三七和冰片三種中藥成分構成，具有疏通血脈、祛除瘀血、順氣止痛的功效，在冠心病、胸悶及心前區刺痛等疾病的治療中發揮著重要的作用［1］。丹參作為該方君藥，其有效物質包括脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸類活性成分，這些物質均具有活血化瘀、改善心臟功能等作用［2］，2020版《中國藥典》（一部）復方丹參片質量標準項下以丹參酮ⅡA 為指標控制其丹參酮類成分的含量。丹參中的二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 等丹參酮類成分受品種、產地、栽培、采收和加工等因素的影響，研究表明陜西、山東、四川等產地的丹參中丹參酮類成分的含量高于安徽、河北、湖北等產地［3-4］。2020版《中國藥典》（一部）中復方丹參片質量標準項下規定，丹參以乙醇為溶劑回流提取、濃縮后，與三七粉、冰片粉及輔料混勻后制得［5］，而丹參的提取時間和溫度、真空度等生產工藝對丹參酮類成分影響較大。調查研究顯示，全國有700多家企業生產復方丹參片，但不同廠家之間復方丹參片的有效成分含量差異較大［6-8］。因此，本實驗以丹參酮ⅡA為內參物，采用一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）測定了10個不同生成廠家復方丹參片中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA成分的含量，以便了解不同廠家4 種丹參酮類成分含量的差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器

230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀及LC-2030 型高效液相色譜儀（日本島津）；KQ-250DB 型數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D 型高精度電子天平（日本島津）。

1.2 色譜柱

Thermo ODS-2 HYPERSIL、ICHROM C18、Agilent ZORBAX SB-C18規格均為4.6 mm×250 mm，5μm。

1.3 試劑和藥品

二氫丹參酮Ⅰ（批號180109，含量＞98%），隱丹參酮（批號171024，含量＞98%），丹參酮Ⅰ（批號170926，含量＞98%），丹參酮ⅡA（批號171106，含量＞98%）對照品購自上海融禾醫藥科技有限公司；甲醇（天津市凱通化學試劑有限公司）；復方丹參片均為薄膜衣小片（0.32 g/片），生產廠家和批號為：廠家1，批號ZBC1810；廠家2，批號201905033；廠家3，批號180309；廠家4，批號3181019；廠家5，批號190319；廠家6，批號190508；廠家7，批號17120615；廠 家8，批 號20190102；廠 家9，批 號B19A026；廠家10，批號18112201。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品儲備液的制備 精密稱取二氫丹參酮對照品10 mg置于250 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度。再分別精密稱取隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品5 mg置于25 mL棕色容量瓶中，用40μg/mL的二氫丹參酮對照品溶液適量溶解，并定容至刻度，制得二氫丹參酮濃度為40μg/mL、其他三種成分濃度均為200μg/mL的混合對照品儲備液，后續實驗中所有的對照品工作液臨用前均用0.22μm膜過濾，收集續濾液進樣測定。

2.1.2 供試品溶液的制備 取復方丹參片10 片，稱量總重，研成細粉，精密稱取細粉約200 mg，置于10 mL 容量瓶中，加適量甲醇超聲提取，定容后用0.45μm濾膜濾過，收集續濾液進樣測定。

2.2 標準曲線法

2.2.1 色譜條件 色譜柱Ichrom C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（80∶20），流速1.0 mL/min；室溫；進樣量20μL；檢測波長270 nm。

2.2.2 線性關系考察 精密量取混合對照品儲備液，用甲醇將其稀釋成一系列不同濃度的混合對照品工作液（其中二氫丹參酮的濃度為2、4、8、12、16、20 μg/mL；其他3 種成分濃度為10、20、40、60、80、100μg/mL）。按照“2.2.1”項下的色譜條件依次進樣，并以濃度（c）為橫坐標，對應峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸分析（見表1）。結果表明，在測定濃度范圍內，這4種成分的線性范圍良好。

表1 線性關系考察結果

2.2.3 穩定性實驗 取云南白藥集團的復方丹參片細粉按“2.1.2”方法制成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h按“2.2.1”項下的色譜條件依次進樣，得4種成分峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分 別 為3.00%、3.00%、2.00%、3.00%。結果表明，供試品溶液在8 h內穩定性良好。2.2.4 重復性考察 精密稱取6 份云南白藥集團股份有限公司的復方丹參片粉末200 mg，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.2.1”項下的色譜條件依次進樣，測定這4 種丹參酮類成分的峰面積，計算RSD。結果表明二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA 4種成分的RSD分別為0.74%，1.23%，1.48%，1.02%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 精密度考察 精密量取“2.1.1”項下的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，連續進樣5次，測定4種丹參酮類成分的峰面積，并計算RSD。計算得二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA 峰面積的RSD 分別為1.17%、1.27%、1.75%、1.00%，說明本法精密度良好。

2.2.6 加樣回收率 精密稱取6 份云南白藥集團股份有限公司的復方丹參片細粉200 mg，按“2.1.2”項下的方法制備樣品溶液。精密量取該樣品溶液和混合對照品溶液各1 mL 置于同一容量瓶中，得6 份混合溶液。按“2.2.1”項下色譜條件，測4 種藥效成分的峰面積并計算回收率及RSD值（表2）。結果表明，回收率良好，本法準確度較高。

表2 二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA加樣回收率結果

2.3 樣品含量測定

將“2.1.2”項下制備的供試品溶液按“2.2.1”項下色譜條件進行含量測定，得到4 種成分的峰面積并計算其含量，結果見表3。

表3 10個廠家樣品中4種丹參酮類成分的含量測定結果

2.4 QAMS法

2.4.1 相對校正因子測定 以丹參酮ⅡA（d）為內標，分別計算二氫丹參酮（a）、隱丹參酮（b）、丹參酮Ⅰ（c）的相對校正因子，在不同進樣體積下的測定。結果見表4。

表4 不同進樣體積下相對校正因子的結果

2.4.2 QAMS 法耐用性考察 考察使用島津LC-20AT、島津LC-2030 和Elite 高效液相色譜系統，以 及 使 用Thermo ODS-2 HYPERSIL、Ichrom C18、Agilent ZORBAXSB-C1 3 種不同廠家色譜柱對相對校正因子的影響，4 種待測成分在不同色譜柱和不同儀器上的相對校正因子，見表5。結果表明相對校正因子在不同高效液相色譜儀及色譜柱下的重現性良好。

2.4.3 QAMS 法待測組分色譜峰的定位 為了在僅采用丹參酮ⅡA 為對照品時，能夠通過獲得的相對校正因子同時計算3 種成分的量，達到一測多評的目的，本研究考察了使用不同儀器和不同色譜柱時丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮與丹參酮ⅡA 的相對保留時間，以觀察待測成分色譜峰在色譜圖上定位的準確性，見表6。丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮與丹參酮ⅡA相對保留時間的RSD分別為3.00%、1.28%、4.38%，表明相對保留時間可作為目標峰的定位參數。因此，通過丹參酮ⅡA 的保留時間，再根據相對保留時間，就可以判斷出目標峰的準確位置。

表6 相對保留時間考察結果

2.5 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件進行數據分析，采用t檢驗對外標法和QAMS 法結果進行比較，采用單因素方差分析對10個廠家的復方丹參片進行組間比較，檢驗水準α=0.05。

2.6 外標法與QAMS法測定結果的比較

分別通過外標法和QAMS法計算所有廠家復方丹參片中4種丹參酮類成分的含量，結果見表7。對兩種方法所得的4種成分含量測定結果進行t檢驗，二氫丹參酮的P值為0.828，丹參酮Ⅰ的P值為0.847，隱丹參酮的P值為0.738，表明兩種方法所得的含量測定結果差異無統計學意義。

表7 外標法與一測多評法對10個廠家復方丹參片中待測成分的測定結果比較

2.7 不同廠家復方丹參片的組間方差分析

對10個廠家復方丹參片中的二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA 的含量分別進行組間方差分析，二氫丹參酮的P值為0.000 02，差異具有統計學意義；丹參酮Ⅰ的P值為0.006，隱丹參酮和丹參酮ⅡA的P值為0.011，不同廠家的4種成分含量差異均具有統計學意義。

3 討 論

3.1 相對校正因子結果分析

實驗證明在不同色譜柱、不同儀器等條件下，以丹參酮ⅡA 為內參物，相對校正因子重現性良好（RSD為2.29%～4.01%），又考察了使用不同儀器和不同色譜柱時丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮與丹參酮ⅡA的相對保留時間，可以判斷目標峰的準確位置（RSD為1.28%～4.38%）。對外標法和QAMS 法所得的4 種有效成分含量測定結果進行t檢驗（P＞0.05），說明相對校正因子可用于計算復方丹參片中丹參酮類活性成分的含量，結果準確可靠。

3.2 不同廠家復方丹參片有效成分的含量對比分析

本實驗對10個不同廠家復方丹參片中4種有效成分的含量進行比較。復方丹參片中丹參酮ⅡA等成分的含量符合2020版《中國藥典》（一部）的規定，但不同廠家的復方丹參片有效成分的含量波動范圍較大，其中二氫丹參酮的含量0.034～0.083 mg/片，隱丹參酮的含量0.118～0.381 mg/片，丹參酮Ⅰ的含量0.082～0.217 mg/片，丹參酮ⅡA 的含量0.221～0.427 mg/片，各有效成分的高低值相差2倍以上?？紤]其原因可能是復方丹參片的原料和生產工藝的差別，不同產地的丹參生長環境不同導致丹參中的藥效成分含量差異較大，如產地為陜西的復方丹參片中丹參酮類成分較高，主要是由于陜西氣候、水分、光照等環境因素更適合丹參的生長［9-11］。丹參酮類成分熱穩定性差、見光易分解，應在陰涼干燥（40 ℃～60 ℃）的條件下加工丹參藥材［12-13］。在丹參提取液濃縮成膏時，可引入冷凍干燥等新工藝減少溫度、光等因素對有效成分的破壞［14-15］。復方丹參片的臨床療效與內在質量有著密切關系，因此在生產過程中應嚴格控制溫度、真空度、時間等參數，以保證質量一致性，提高臨床療效。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突