橙皮提取液合成載銀石墨烯研究

謝東梅 徐 丹 任 丹

(西南大學食品科學學院，重慶 400715)

抗菌包裝可通過與食品表面接觸發揮抗菌作用，達到抑制食品在貯藏過程中的微生物生長，延緩腐爛變質并避免二次污染的目的。因此，抗菌包裝的應用可有效防止食品在流通和銷售過程中的微生物污染，延長食品的貨架期，還可大大減少食品加工過程中化學添加劑的用量，并盡可能地保持食品的品質，增強食品的安全性，因此成為目前食品包裝材料的研究熱點之一。目前的抗菌包裝材料大多是通過添加一定的抗菌劑，賦予其抗菌能力。納米銀(AgNPs)因其優異的抗菌性能和良好的安全性，成為醫藥和食品等領域最有應用潛力的抗菌填料之一[1]。已有研究表明，含AgNPs的保鮮膜可有效延長雞蛋的貨架期[2]，保持黃瓜的貯藏品質[3]，抑制南豐蜜桔果實霉菌的生長[4]，以及延長冷藏蝦仁的保質期[5]等。但AgNPs尺寸較小，易發生遷移而導致安全隱患。如能將其進行固載或與其他材料復合則可降低其安全風險。

石墨烯(Graphene)因其絕佳的機械性能、耐熱性和巨大的比表面積等優良性能被譽為21世紀“革命性材料”。將其加入有機高分子材料中，可大大增強高分子材料的力學性能、阻隔性和耐熱性。而氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)含有大量的—OH和—COOH等含氧基團，可通過物理吸附、靜電引力和電荷轉移等相互作用吸附和固載Ag+，并通過還原劑將其還原為納米銀粒子(AgNPs)固載于GO片層表面，從而有效減少顆粒的遷移[6]，并可有效地抑制石墨烯在高分子基材中的團聚[7]，使其更好地發揮納米增強作用。

采用天然還原劑如植物提取物等來制備納米粒子及其復合物具有綠色安全等優點[8]，尤其適用于醫藥和食品領域的納米粒子的合成。例如采用慈姑(Syzygiumcumini)種子提取物合成納米金裝飾的還原氧化石墨烯(rGO)[9]，采用松樹葉提取液合成納米銀裝飾的rGO[10]等都已被報道過。而橘皮作為世界主要水果之一柑橘的主要副產物，含有豐富的類黃酮、酚酸和VC等還原性成分，是優良的天然還原劑之一。但尚未有報道采用橘皮提取物來合成納米銀和石墨烯的復合物。本課題組[11]前期采用橘皮提取液成功合成了納米銀，并對橘皮種類進行了篩選。在此基礎上，本研究擬采用澳橙果皮提取液作為還原劑及穩定劑，制備載銀石墨烯(rGO-Ag)。通過單因素試驗探究反應時間、反應溫度和AgNO3濃度對rGO-Ag反應率、粒徑大小及穩定性的影響。由此設計正交試驗，以平均粒徑作為考察指標，確定澳橙果皮提取液合成rGO-Ag的最優工藝，并對rGO-Ag的結構進行表征，以期為rGO-Ag在抗菌包裝中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮澳橙(Citrussinensis)：重慶市北碚區永輝超市；

石墨粉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

濃硫酸(質量分數為98%)、濃鹽酸(質量分數37%)：優級純，重慶川東化工(集團)有限公司；

雙氧水(質量分數為30%)、硝酸銀、氫氧化鈉、高錳酸鉀、硝酸鈉、檸檬酸三鈉：分析純，成都科龍化工試劑廠；

超純水：實驗室自制。

1.1.2 儀器與設備

冷凍干燥機：LGJ-10型，北京松源華興科技發展有限公司；

冷凍離心機：Avanti-J-301型，美國貝克曼庫爾特公司；

紫外分光光度計：UV-2450型，日本島津公司；

馬爾文粒度儀：Nano-ZS90型，英國馬爾文公司；

透射電子顯微鏡(TEM)：JEM-1200EX型，日本電子公司；

傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)：Spectrun100型，美國Perkinelmer公司；

激光共聚焦顯微拉曼(Raman)光譜儀：Scientific DXR2型，美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 果皮提取液的制備 將新鮮的澳橙洗凈晾干，果皮剝下切成小塊，裝于自封袋中，置于-20 ℃冰箱冷藏備用。取50 g冷藏橙皮加入到300 mL超純水中，用榨汁機打碎后倒入1 000 mL燒杯中，95 ℃水浴中攪拌20 min。冷卻后用紗布過濾，去除橙皮渣。再將濾液以6 000 r/min 離心10 min。上清液抽濾以進一步去除提取液中的細小橙皮渣。制得的橙皮提取液置于4 ℃冰箱內待用。

1.2.2 GO的制備 參照改進的Hummers方法[12]。步驟如下：將2 g硝酸鈉、2 g石墨粉和95 mL 98%濃硫酸添加到1 000 mL圓底燒瓶中混合后，超聲波處理1 h。在冰水浴條件下800 r/min攪拌2 h。然后緩慢添加12 g高錳酸鉀并在45 ℃水浴中繼續攪拌2 h，再緩慢加入100 mL 超純水。將混合液冷卻10 h后，緩慢加入50 mL 30%過氧化氫溶液。自然冷卻后，將所得混合物先用5%稀鹽酸溶液多次離心清洗，再用超純水反復離心清洗，直至離心所得上清液為中性。離心所得固體即為GO，用超純水溶解后超聲波處理2 h。標定GO濃度(6.8 mg/mL)后，置于冰箱4 ℃下保存備用。

1.2.3 rGO-Ag的合成 向150 mL錐形瓶中分別加入30 mL橙皮提取液，1 mL稀釋至68 mg/LGO和1 mL 0.01 mol/L 檸檬酸鈉，再加入20 mL一定濃度AgNO3溶液以及28 mL超純水。超聲0.5 h后，在不同溫度下反應一定時間。待冷卻后，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，將所得沉淀冷凍干燥(真空度<10 Pa，冷阱溫度<-50 ℃)，即為rGO-Ag。

1.2.4 單因素試驗設計

(1) 反應時間：以AgNO3濃度10 mmol/L，油浴溫度90 ℃為基礎條件?？疾旆磻獣r間(1，2，3，4，5，6 h)對rGO-Ag反應率、粒徑大小及穩定性的影響。

(2) 反應溫度：以AgNO3濃度10 mmol/L，反應時間4 h為基礎條件?？疾煊驮囟?70，80，90，100 ℃)對rGO-Ag反應率、粒徑大小及穩定性的影響。

(3) AgNO3濃度：以反應時間4 h，油浴溫度100 ℃為基礎條件，考察AgNO3濃度(5，10，15，20，25，30 mmol/L)對rGO-Ag反應率、粒徑大小及穩定性的影響。

1.2.5 正交設計試驗優化 在單因素試驗基礎上，選取反應時間、溫度、AgNO3濃度3個因素中的4個水平，以反應后稀釋相同倍數反應液的平均粒徑作考察指標，采用L16(45)的正交試驗表頭設計，以確定橙皮提取液還原制備rGO-Ag的最優條件。

1.2.6 rGO-Ag的表征

(1) 紫外—可見光譜測定：取適量用超純水稀釋后的rGO-Ag反應溶液于石英比色皿中，采用UV-2450紫外分光光度計進行掃描，波長范圍200～800 nm。

(2) 粒徑和Zeta電位測定：取1 mL超純水稀釋后的rGO-Ag反應溶液于粒徑樣品池中，用馬爾文激光粒度儀測定rGO-Ag平均粒度值。另取上述稀釋液1 mL至Zeta電位樣品池中，測定溶液Zeta電位值。

(3) TEM分析：將少量GO、rGO及最優工藝條件制備得到的rGO-Ag粉末置于無水乙醇中，采用細胞粉碎儀進行高頻超聲分散，然后滴至銅網上，采用TEM對樣品的表面形貌進行觀察，并使用Image-ProPlus 6.0軟件分析和統計rGO上負載的AgNPs的粒徑大小。

(4) Raman光譜測定：取少量rGO、GO及最優工藝條件制備得到的rGO-Ag粉末分別置于載玻片上，將其壓實后，利用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀在室溫下進行Raman光譜測試。掃描波數范圍50～2 500 cm-1，激發波長532 nm。

(5) FTIR光譜測定：將橙皮提取液、GO、AgNPs及最優工藝條件制備得到的rGO-Ag進行冷凍干燥得到粉末，采用KBr壓片法制備樣品，掃描波數范圍400～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1，掃描次數32次。

1.3 數據分析

數據均用Origin Pro 8.6作圖，采用SPSS 18進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結果以(平均值±標準差)表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 反應時間的影響 由圖1(a)可知，rGO-Ag在430 nm 左右有1個明顯的吸收峰，與AgNPs表面等離子體共振峰一致[13]。隨著反應時間的延長，該吸收峰的峰值不斷增加，表明溶液中AgNPs濃度逐漸升高，反應率逐漸提高。但反應時間超過4 h后，增加速度減緩，說明反應逐漸達到飽和[10]。

由圖1(b)可知，當反應時間從1 h增加至4 h時，rGO-Ag的平均粒徑降低了41.2%。此時繼續延長反應時間，平均粒徑仍呈下降趨勢，但下降不明顯?？赡苁欠磻跗趓GO尚未被完全分散，隨著反應的進行，rGO上附著的AgNPs逐漸增多，且吸附了橙皮提取液中的果膠，使得生成的rGO-Ag能更好地分散，粒徑減小[7, 9, 14]。納米分散液的Zeta電位絕對值是衡量其在溶液中穩定性的一個重要指標。通常情況，當其絕對值高于30 mV，則認為該分散體系非常穩定[15]。rGO-Ag的Zeta電位為負值，表明其表面帶負電荷，且絕對值均分布在25～27 mV，表明其在水相中能較為穩定地分散。同時，反應時間對rGO-Ag溶液的穩定性影響較小。

2.1.2 反應溫度的影響 由圖2(a)可知，隨著反應溫度的升高，rGO-Ag在430 nm處吸收峰的強度明顯增加，說明反應溫度對AgNPs的反應率有較大影響。且由圖2(b) 可知，提高反應溫度可顯著降低rGO-Ag的平均粒徑?？赡苁巧邷囟瓤杉涌旆磻俾蔥16]，并有利于AgNPs晶體成核[17]。但隨著反應溫度的提高，rGO-Ag溶液的Zeta電位絕對值略有下降。

大寫字母不同表示Zeta電位絕對值差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示平均粒徑差異顯著(P<0.05)

圖1 反應時間對rGO-Ag的影響

Figure 1 Effects of reaction time on rGO-Ag

2.1.3 AgNO3濃度的影響 由圖3(a)可知，隨著AgNO3濃度的增加，rGO-Ag在430 nm處的吸收峰值不斷增加。但當濃度超過25 mmol/L時，增速減緩，可能是Ag+濃度過高，導致橙皮提取液中的還原劑大量消耗使其濃度降低。由圖3(b)可知，當AgNO3濃度為5～25 mmol/L時，所得rGO-Ag的平均粒徑均較為穩定地分布在240 nm附近。當AgNO3濃度為30 mmol/L時，rGO-Ag的平均粒徑有顯著增加，表明生成的AgNPs開始團聚?？赡苁钱擜gNO3濃度較低時，晶體生長速度受限[14]。隨著AgNO3濃度的進一步增加，晶體生長速率增加，當其生長速度大于成核速度時，粒徑逐漸增大[17]。此外，當 AgNO3濃度在5～10 mmol/L時，rGO-Ag溶液的Zeta電位絕對值變化不顯著。而濃度進一步增加時，溶液的Zeta電位絕對值則顯著降低。由此可知，AgNO3濃度過高會降低rGO-Ag溶液的穩定性。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果確定時間、溫度、AgNO3濃度3個因素的4個水平，采用L16(45)的正交試驗表頭設計進行試驗。因素水平設計如表1所示。以反應后得到的rGO-Ag平均粒徑大小為考察指標，對正交試驗結果進行直觀分析和方差分析，所得結果分別見表2、3。由表2 可知，3個因素對rGO-Ag平均粒徑的影響順序為反應溫度>反應時間>AgNO3濃度。此外，與代表了試驗誤差[18]的空白列極差值相比，反應時間、反應溫度和AgNO3濃度3個因素均具有較高的極差值，表明3個因素的水平效應間存在差異。表3中的P值進一步驗證了上述3個因素對rGO-Ag平均粒徑大小的影響作用。因此，由正交試驗結果得出制備rGO-Ag的最佳工藝條件為A4B4C3，即反應時間為4 h，反應溫度為100 ℃，AgNO3濃度為25 mmol/L。在此條件下，所得rGO-Ag的平均粒徑為249 nm。

大寫字母不同表示Zeta電位絕對值差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示平均粒徑差異顯著(P<0.05)

圖2 反應溫度對rGO-Ag的影響

Figure 2 Effects of reaction temperature on rGO-Ag

表1 正交試驗因素水平表

大寫字母不同表示Zeta電位絕對值差異顯著(P<0.05)；小寫字母不同表示平均粒徑差異顯著(P<0.05)

圖3 AgNO3濃度對rGO-Ag的影響

Figure 3 Effects of AgNO3concentrations on rGO-Ag

2.3 rGO-Ag的結構表征

采用TEM對GO、rGO和rGO-Ag的微觀形貌進行表征。由圖4(a)、(b)可知，GO表面平整、光滑，呈透明薄片狀，而rGO透明度降低，褶皺增加，可能是橙皮提取液中的有機物附著其上所致。由圖4(c)可觀察到rGO-Ag片層的透明度降低，且表面附著了大量納米尺寸的球形顆粒，表明AgNPs成功負載到rGO片層上。圖4(d)是根據TEM圖統計得出的rGO-Ag上負載AgNPs的粒徑分布。結果顯示，AgNPs的尺寸分布范圍為3～50 nm，且有46.3%分布在10～20 nm，平均粒徑為21 nm。

圖5(a)所示的GO、rGO和rGO-Ag的Raman光譜可進一步揭示其結構變化。GO的2個特征峰D、G峰分別出現在1 344，1 593 cm-1。其中，G峰是由sp2雜化的碳原子振動產生，對應于布里淵區中心的E2g聲子[19]。D峰為缺陷峰，由sp3雜化的碳原子振動產生，當石墨烯片層邊緣的對稱性被破壞或樣品存在缺陷時便會出現。因此，D峰和G峰的強度比(ID/IG)值越大，表明石墨烯的氧化程度越大。由Raman光譜中二者的強度計算可得，GO、rGO和rGO-Ag的ID/IG值分別為0.88，0.84，0.75。由此表明，GO可被橙皮中的還原成分還原成rGO，結構對稱性增加。而rGO-Ag的ID/IG值進一步減小，可能是由于納米銀粒子的吸附增加了電子碰撞[20]。此外，由于AgNPs的表面增強散射(SERS)，rGO-Ag樣品中D和G帶的峰強度顯著增加[21]。

表2 正交試驗設計與結果分析

表3 方差分析結果

圖5(b)所示為橙皮提取液、rGO-Ag、GO和AgNPs的FTIR譜圖。GO在1 621，1 724，1 000～1 368 cm-1處出現了特征吸收峰，分別對應于碳骨架上C═C鍵的伸縮振動峰、羧酸和羰基中的C═O伸縮振動峰，及C—O伸縮振動峰[22]。與GO相比，rGO-Ag譜圖中含氧基團的吸收峰強度顯著降低，說明其已被還原。且rGO-Ag在1 545，1 454 cm-1與AgNPs的特征吸收峰一致，進一步表明AgNPs已成功負載到rGO上。

圖4 TEM圖及rGO-Ag粒徑分布圖

圖5 Raman圖譜及紅外吸收光譜

3 結論

本研究以澳橙果皮提取液作為還原劑及穩定劑，通過綠色還原法制備了rGO-Ag。單因素試驗表明，延長反應時間、提高反應溫度和適當增加AgNO3濃度均可提高AgNPs的反應率，降低其平均粒徑。正交試驗明確了rGO-Ag平均粒徑的影響因素主次順序為：反應溫度>反應時間>AgNO3濃度，并確定了制備rGO-Ag的最佳工藝條件為反應時間4 h，反應溫度100 ℃，AgNO3濃度25 mmol/L。在此工藝條件下，GO可被橙皮提取液還原，且片層上成功負載了粒徑范圍為3～50 nm AgNPs。后續研究可將制得的rGO-Ag用作抗菌納米填料，添加到高分子基材中制備納米抗菌包裝材料。