山藥水溶性蛋白質凝膠特性的研究

高 琦,于昊蕊,陳佳男,王曉文,張俊偉,薛友林,*

(1.遼寧大學輕型產業學院,遼寧沈陽 110036; 2.遼寧行政學院,遼寧沈陽 110161)

山藥是薯蕷科薯蕷屬(Dioscoreaspp,Dioscoreaceae)的一種常見的塊莖作物,具有藥食兼用的特點,為一年或多年生蔓生草本植物[1]。我國擁有豐富的山藥資源,種植面積廣,具有較高的產量和悠久的藥用歷史,具有降血脂,降血糖,抗衰老,調理腸胃,增強免疫等功能[2]。通常山藥(干重)中淀粉含量為75%～84%,粗蛋白含量為6%～8%,粗纖維含量為1.2%～1.8%[3]。另外,山藥中含有多種生物活性物質,例如:酚類化合物、糖蛋白、多糖、甾體皂甙等,其還含有豐富的人體需要的必需氨基酸等17種氨基酸,其中谷氨酸和精氨酸含量較高[4],故擁有較高的營養價值。山藥儲藏蛋白Dioscorin占山藥總可溶性蛋白(YSP)的80%,其分子量為31 kDa,且在體內和體外都能表現出較好的生物活性,包括碳酸酐酶活性、胰蛋白酶抑制劑活性、抗氧化活性、免疫調節活性、抗高血壓活性、凝集素活性、呼吸道上皮細胞保護活性等[5],因此有作為保健品或食品功能性添加成分的潛力,需要對其加工特性進行深入研究[6]。實驗室前期研究表明,YSP具有較好的溶解性、持油力及乳化活性,這些能力對其應用于食品體系來說十分重要[7]。

蛋白的膠凝作用是指變性蛋白分子聚集并形成有序的蛋白質網絡結構的過程,是蛋白質的一種重要的功能性質,同時其凝膠的流變學特性也可以作為調整食品物理性質的重要依據[8]。此外,蛋白的凝膠行為及其流變學性質與某些食品中獨特的質構、風味、感觀品質、保水性和保留其他成分的能力有著密不可分的關系[9]。在食品中添加植物蛋白,例如大豆分離蛋白[10],可以增加其水分含量,由于其良好的凝膠組織性,使食品的質構和口感得到很好的改善,同時在一定程度上可以降低食品中脂肪含量,顯著提高食品的營養價值和商品價值。

目前,國內外對YSP的研究一般集中在蛋白質的提取工藝的優化,還有物理性質和功能性質的研究,例如:溶解度、起泡性及泡沫穩定性、乳化性及穩定性等[11],但是對山藥蛋白質凝膠特性的詳細研究鮮有報道。有研究認為,蛋白質凝膠形成受加熱溫度、加熱時間、pH、蛋白質濃度、離子強度等因素的影響[12]。因此,本文利用質構儀和流變儀對YSP的凝膠特性進行研究,可以為綜合開發山藥新產品提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白玉山藥 沈陽十二線果品蔬菜批發市場;氯化鈉、亞硫酸氫鈉 均為分析純;甲基硅油 國藥集團化學試劑有限公司。

PHS-3CB型pH計 上海越平科學儀器有限公司;TG16G臺式高速離心機 長沙英泰儀器有限公司;FB124電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;LGJ-10型冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司;CT3質構儀 美國博勒飛Brookfield;TH-400 BQ型數控超聲波清洗機 濟寧天華超聲電子儀器有限公司;磁力攪拌器 上海凌科實業發展有限公司;恒溫水浴鍋 上海啟前電子科技有限公司;漩渦振蕩器 廣東安勝儀器有限公司;TA-DHR2型流變儀 美國TA儀器;Microza MF/UF小型膜試驗設備 日本Asahi Kasei公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 YSP的提取 首先將山藥洗凈、去皮、切塊,加入一定量的冰水抽提溶液進行打漿(料液比為1∶2),并加入1%的亞硫酸氫鈉作為護色劑,用1 mol/L的NaOH調節pH至9,在4 ℃時磁力攪拌20 min,5000 r/min離心30 min,雙層紗布過濾后取上清液,用2 mol/L的HCl調節pH至3.5(根據初步研究確定山藥可溶性蛋白的等電點pI=3.5),4 ℃磁力攪拌1 h后,5000 r/min離心30 min,雙層紗布過濾,得到的沉淀加水回溶,用1 mol/L的NaOH調節pH至7,最后經過超濾(截留物質的分子量為10 kDa)、冷凍干燥獲得YSP[13]。

1.2.2 YSP最小凝膠濃度的測定 根據Aluko等的方法[14],測定YSP的最小凝膠濃度(LGC),將不同蛋白質濃度(2%～14%,w/v)(2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%)的樣品懸浮在水中,95 ℃水浴1 h,在自來水中冷卻,然后放在冰箱(4 ℃)冷卻2 h。取出燒杯并倒置,其最低樣品濃度使凝膠不滑動即為最小凝膠濃度。

1.2.3 YSP凝膠的制備

1.2.3.1 不同YSP濃度的凝膠的制備 分別取YSP 0.40、0.50、0.60、0.70 g于燒杯中,并加入蒸餾水,分別配制成質量濃度為8%、10%、12%、14%的YSP溶液,調節pH=7,漩渦振蕩器攪拌10 min,95 ℃水浴1 h,然后4 ℃冷卻24 h,即得到不同蛋白質濃度的凝膠。

1.2.3.2 不同pH的YSP凝膠的制備 固定YSP濃度為8%,分別調節pH為8、9、10、11,后續處理同1.2.3.1,即得到不同pH下的凝膠。

1.2.3.3 不同NaCl濃度的YSP凝膠的制備 固定YSP濃度為8%,體系的pH為7,將YSP分別溶于不同濃度的NaCl(0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L)溶液中,后續處理同1.2.3.1,即得到不同NaCl濃度的凝膠。

1.2.4 YSP凝膠流變性質的測定 將制備好的凝膠置于流變儀平行板之間,間隙設為1 mm,抹去過多的樣品,并在樣品裸露的邊緣處涂上一層薄薄的甲基硅油,避免水分蒸發[15]。隨著時間的變化,測定不同溫度下G′(儲能模量,Storage modulus)、G″(損耗模量,Loss modulus)、剪切速率的變化。在振蕩(oscillation)和溫度梯度(temperature ramp)模式下設置升溫程序(起始溫度25 ℃,終止溫度95 ℃)和降溫程序(起始溫度95 ℃,終止溫度25 ℃),升溫和降溫速率均為5.0 ℃/min,角頻率(angular frequency)為1.0 rad/s[16]。最后在25 ℃下進行頻率掃描(frequencysweep),頻率掃描范圍為0.1～10 Hz。

1.2.5 YSP凝膠持水性的測定 利用離心法測量凝膠持水性(water holding capacity,WHC),將濃度分別為8%、10%、12%、14%的YSP溶液1 mL放置在1.5 mL的離心管中,至于恒溫水浴鍋中,保持水浴溫度為95 ℃,在此條件下加熱1 h蛋白形成凝膠,燒杯從水浴中取出置于常溫流水中冷卻,冷卻至室溫,放于4 ℃冰箱冷卻24 h待測。將離心管從冰箱取出,放置在室溫下,當溫度達到室溫時,以6000 r/min的速度離心15 min,用濾紙條吸取離心出來的水,記錄離心管、離心前離心管與凝膠的重量和離心后離心管與凝膠的重量,凝膠持水性計算如下:

式中:WHC為凝膠持水性;W1為離心管重(g);W2為離心前離心管與凝膠的重量(g);W3為離心后離心管與凝膠的重量(g)[17]。

1.2.6 YSP凝膠質構的測定 凝膠特性利用質構儀進行測定,采用texture profile analysis(TPA)運行模式。測試前速度為2.00 mm/s,測試速度為2.00 mm/s,測試后速度2.00 mm/s,穿刺距離為2.0 mm,間隔時間為5 s,數據頻率200 pps[18],探頭為TA11/1000圓柱型。

1.3 數據處理

利用OriginPro8、IBM SPSS Statistics 19等軟件進行作圖和數據分析。

2 結果與分析

2.1 YSP的最小凝膠濃度

植物蛋白在加熱時形成凝膠的能力在食品加工和食品功能特性配方中有很大作用。蛋白質凝膠形成能力和粘彈性與內部結構、共價鍵和氫鍵、靜電和疏水相互作用有密切關系。Sathe等研究發現蛋白的溶解性和非蛋白成分可以影響凝膠形成[19]。根據表1結果顯示,山藥蛋白的最小凝膠質量分數為8%,表明山藥水溶性蛋白質具有較好的凝膠能力。

表1 YSP最小凝膠濃度的測定結果Table 1 Determination result of the minimum gel concentration of YSP

2.2 YSP的凝膠特性

蛋白質凝膠實際上是蛋白質-蛋白質、蛋白質-溶劑及相鄰肽鏈間吸引力、排斥力相互平衡的結果。形成蛋白質凝膠的作用力與穩定蛋白質三維結構的作用力大致相同。除在蛋白凝膠結構中占主導地位的共價鍵外,一般認為,一些物理作用力如疏水相互作用、靜電相互作用等也參與蛋白凝膠網絡結構的形成。其中一些觀點認為,凝膠的流變特性與凝膠聚集的顆粒大小、顆粒的體積分數以及凝膠的分形維數密切相關[20]。

2.2.1 YSP濃度對山藥蛋白質凝膠特性的影響 儲能模量G′代表能量儲存后可恢復的彈性性質,損耗模量G″代表能量消散的粘性性質[21]。根據圖1(a、b)的動態流變結果和表2的質構結果顯示,所測樣品的G′均大于G″,隨著蛋白質濃度增大,G′與G″均顯著增大(p<0.05),山藥蛋白質凝膠的硬度也隨著YSP濃度的增大而增大。根據頻率掃描的測定顯示,由圖1c可知,損耗角正切值tanδ在測試的頻率范圍內,隨著蛋白質濃度的升高而降低,表明在不同頻率下,蛋白質濃度越小的凝膠,流動性越好,tanδ為G″與G′比值,tanδ越大,表明體系的粘性比例越大,流動性強,反之則彈性比例較大[22]。相同蛋白質濃度的G′曲線和G″曲線變化趨勢基本相同,且G′>G″,tanδ<1,說明YSP凝膠以彈性為主體系,隨著蛋白質濃度增大,彈性增強,具有較強的結構性[23]。這表明增大蛋白質濃度有助于凝膠具有更好的粘彈性和硬度。由于蛋白質濃度增大,單位體積內蛋白質分子的碰撞與纏結幾率增大,氫鍵相互作用增強[24],同時,蛋白質分子間熱運動隨溫度升高而加劇,導致流動阻力減小。

圖1 YSP濃度對山藥蛋白質凝膠G′(a)、G″(b)、和tanδ(c)的影響Fig.1 Effects of YSP concentration on the G′(a),G″(b)and tanδ(c)of YSP gel

蛋白質之間交聯聚集形成的凝膠網絡結構可以鎖住并保持水分,網絡結構鎖住水分能力的大小,是在食品應用中衡量凝膠優劣的一個重要指標[25]。如表2所示,山藥蛋白質凝膠具有良好的持水性,這種良好的持水性和凝膠的蛋白質濃度呈正相關,也和其蛋白質良好的溶解性有關[26]。凝膠的硬度的增大也有利于水的保持。所以隨著蛋白質濃度的增加,凝膠的持水性也有所增大,當蛋白質濃度大于12%時,持水性達到70%以上。這種良好的持水性,可以使山藥蛋白凝膠廣泛應用于食品工業中,如肉類替代品,烘焙食品等?？梢愿鶕z的持水性,在生產中調節水的用量來處理新產品的感官性狀。

蛋白質濃度(w/v)硬度(N)彈性(mm)持水性(%)8%0.24±0.05b0.84±0.00b56.46±0.14c10%0.26±0.02b0.92±0.04ab56.97±0.06c12%0.28±0.00ab0.90±0.03ab73.38±0.03b14%0.34±0.04a0.96±0.04a76.68±0.35a

2.2.2 pH對YSP凝膠特性的影響 由圖2可以看出,在所測范圍內,pH=9時,儲能模量G′、損耗模量G″和tanδ達到最大。在90 ℃左右時,凝膠的粘彈性最好,隨著溫度的降低,G′也明顯下降。在堿性的條件下,由表3可以看出,隨著pH的增大,凝膠的硬度、彈性和持水性呈現先增加后降低的趨勢。蛋白質分子中包含羧基與氨基,能夠呈現典型的兩性特征。pH對凝膠的粘彈性有較大的影響,山藥蛋白的等電點在3.5左右,當pH>pI時,凝膠中多數蛋白質通過解離氫離子而帶負電荷,蛋白質分子之間的相互排斥,蛋白質分子與水分子之間的相互作用能有利于蛋白質凝膠網絡的形成[27]。隨著pH提高,凝膠中不溶物也有所減少,持水性較好[28]。pH>9時,蛋白質分子中的凈負電荷密度過大,分子間的靜電斥力就會大于分子間作用,使蛋白質凝膠形成和維持的作用力減弱[29],分子鏈變得比較舒展[30],不利于蛋白質分子的聚集,粘彈性減弱。

圖2 pH對山藥蛋白質凝膠G′(a)、G″(b)、和tanδ(c)的影響Fig.2 Effects of pH on the G′(a), G″(b)and tanδ(c)of YSP gel

表3 pH對山藥蛋白凝膠硬度、彈性和持水性的影響Table 3 Effects of pH on gel hardness,resilience and water holding capacity of YSP

2.2.3 NaCl濃度對YSP凝膠特性的影響 由圖3可以看出,當NaCl濃度為0.1 mol/L時,山藥蛋白凝膠的G′和G″較大;同時,由表4可以看出,當NaCl濃度超過0.05 mol/L時,將使凝膠的硬度降低,這與YSP凝膠形成時的動態過程一致[31]。在不同頻率下,NaCl濃度對tanδ的影響較小。加入少量NaCl有助于凝膠持水性增強。蛋白質凝膠形成首先經歷變性展開,使疏水基團暴露出來,蛋白質分子間作用使之發生交聯形成集聚體,繼而形成穩定的網絡結構。由于中性電解質NaCl溶液影響電荷和極性基團之間的靜電相互作用力,通過對水分子結構的修飾而影響疏水相互作用,加熱蛋白質溶液時,包埋的非極性側鏈暴露出來,從而增強了鄰近多肽間非極性片段的疏水相互作用。適量NaCl的添加能夠減弱分子間斥力作用,可以促進蛋白質交聯聚合[32],形成的凝膠隨機聚集較為粗糙[33]。而高濃度的NaCl會減小蛋白質之間的靜電斥力,屏蔽電荷效應,增大分子間的吸引力,使蛋白質的構象趨于穩定,凝膠的粘彈性硬度減弱[34]。另一方面,高濃度的NaCl還會破壞凝膠中的次級鍵,水合鍵和氫鍵,改變凝膠形成區域周圍水的形態從而破壞凝膠網絡結構的穩定性,使凝膠G′和G″降低。

圖3 NaCl濃度對山藥蛋白質凝膠G′(a)、G″(b)、和tanδ(c)的影響Fig.3 Effects of NaCl concentrationon the G′(a),G″(b)and tanδ(c)of YSP gel

表4 NaCl濃度對山藥蛋白質 凝膠硬度、彈性和持水性的影響Table 4 Effects of NaCl concentration on gel hardness and resilience and water holding capacity of YSP

3 結論

山藥水溶性蛋白質凝膠的粘彈性隨著蛋白質濃度的增大而增大,pH為9時,儲能模量G′、損耗模量G″和tanδ達到最大,NaCl濃度超過0.05 mol/L時,凝膠的硬度較低。在蛋白質濃度為14%,pH為9,NaCl濃度為0.05 mol/L時具有最好的持水性。對其流變性和質構的研究,可以為山藥類食品的創新提供依據。