納豆激酶微膠囊制備及其釋放與Caco-2細胞模型吸收的評價

鄧柳艷,張建華

(上海交通大學農業與生物學院,上海 200240)

納豆激酶(Nattokinase)最初分離自日本發酵食品納豆,是一種由枯草芽孢桿菌產生的堿性絲氨酸蛋白酶[1],由275個氨基酸組成,具有很好的溶栓效果[2]。研究發現,納豆激酶口服攝入后[3],主要在小腸部位被吸收[4],但納豆激酶作為生物大分子,易被胃腸道中蛋白酶水解、在小腸中不易被吸收,因此,生物利用度低[5]。為提高納豆激酶在人體胃腸道中的穩定性,有研究者采用明膠、阿拉伯膠或海藻酸鈉等傳統天然壁材制備納豆激酶微膠囊,但粒徑多為微米級,很少能夠達到納米級別(10～1000 nm)[6-7]。納米級微膠囊具有腸胃刺激小、穩定性高、可靶向運輸等優點,是促進包埋物吸收的有效方式。

此外,小腸絨毛壁的受體轉運吸收等也是常見的吸收促進方式。人體小腸絨毛上皮細胞、腫瘤細胞等可表達葉酸(folic acid,FA)受體[8-9],葉酸可通過與上皮細胞表面受體結合轉運進入機體,如果能將其與高聚物連接作為微膠囊壁材,則有望促進其包埋物的吸收。研究發現,通過化學修飾可將葉酸分子的羧基與聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)中PEG的氨基端連接[10],得到葉酸靶向壁材FA-PEG-PLGA。PEG-PLGA是由聚乙二醇(PEG)和聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)經化學合成得到的高分子聚合物,無免疫原性[11],且具有很好的生物降解性及緩釋特性,是納米級靶向微膠囊壁材的理想選擇[12],已成功用于抗腫瘤藥物[13]及胰島素[14]等蛋白類物質的裝載及靶向運輸。

因此,本實驗將以PEG-PLGA為壁材,以包封率為指標,通過正交試驗探索雙重乳液蒸發法制備納豆激酶微膠囊的最適條件,然后在此條件下制備PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊,并測定兩者表征參數及體外緩釋效果;最后,采用Caco-2細胞對兩種納豆激酶微膠囊的細胞毒性、釋放及細胞吸收效果進行評價,以期對制備納米級葉酸靶向納豆激酶微膠囊的可行性及其促進細胞吸收的效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆激酶(100,000 FU/g) 廣州雙駿生物科技有限公司饋贈;葉酸-聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(FA-PEG-PLGA) 西安瑞禧生物科技有限公司;聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA) 濟南岱罡生物工程有限公司;聚乙烯醇(PVA) 上海麥克林生化科技有限公司;Caco-2細胞系 實驗室凍存;胎牛血清 上海碧云天生物技術有限公司;BCA試劑盒 上海生物技術有限公司;堿性磷酸酶試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline(DPBS)緩沖液、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)細胞培養液 美國Gibco公司;香豆素-6、熒光素鈉等 均為國產分析純。

KMO2磁力攪拌器 德國IKA公司;Nano S90納米粒度分析儀 英國Malvern公司;Omni納米粒度Zeta電位儀 美國BrookHaven公司;L5S棱光紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;5424R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司;LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司;Innova 44恒溫搖床 德國Eppendorf公司;311恒溫二氧化碳培養箱 美國Thermo公司;STED 3X活細胞超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙重乳液蒸發法制備納豆激酶微膠囊 初級乳液制備:取一定量的FA-PEG-PLGA和PEG-PLGA兩種多聚物分別溶解于乙酸乙酯/氯仿(1∶1,v/v)中,備用;取納豆激酶粉末溶于Tris-HCl緩沖液(pH7.4),得10 mg/mL 納豆激酶溶液;分別取1 mL納豆激酶溶液加入5 mL上述兩種多聚物溶液中,1200 r/min磁力攪拌5 min;接著將兩種混合液分別于10000 r/min條件下均質5 min,得W/O型初級乳液。

二級乳液制備:將上述兩種初級乳液分別逐滴加入至一定濃度的PVA溶液(pH7.0)中,并于1200 r/min、4 ℃條件下磁力攪拌5 min;接著于一定轉速下均質一定時間,得到兩種W/O/W型二級乳液[16];最后將所得乳液攪拌至有機試劑完全揮發,多聚物及PVA成膜形成微膠囊。

納豆激酶微膠囊粉末:分別將上述所得乳液于35250×g條件下4 ℃離心30 min,收集沉淀;接著用蒸餾水重懸沉淀、離心,重復三次;收集三次的上清液采用BCA試劑盒測定蛋白含量,收集沉淀進行真空冷凍干燥,即得FA-PEG-PLGA和PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊粉末[15]。

根據蛋白質含量按下式計算納豆激酶的包封率。

包封率(%)=(M0-M1)×100/M0

式中:M0為納豆激酶初始含量(mg),M1為上清液中未包埋的納豆激酶含量(mg)。

1.2.2 正交試驗優化微膠囊制備條件及微膠囊表征 以壁材(PEG-PLGA)濃度A、聚乙烯醇(PVA)濃度B、二級均質轉速C和二級均質時間D為因子,PEG-PLGA納豆激酶微膠囊包封率為指標,采用如表1所示正交實驗設計L9(34)探究最適制備條件。

表1 L9(34)正交實驗設計表Table 1 The orthogonal experimental designTable L9(34)

參考Chen等[13]和Jain等[14]的研究結果,葉酸的結合與否對微膠囊的制備及物理性質無顯著影響。因此,采用PEG-PLGA所得制備條件分別以PEG-PLGA、FA-PEG-PLGA為壁材制備兩種納豆激酶微膠囊,最后分別采用納米力度測定儀測定微膠囊平均粒徑和多分散系數(PDI),納米粒度Zeta電位儀測定ζ電位。

1.2.3 香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊制備 采用1.2.2中所得條件分別以PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA為壁材,以香豆素-6為熒光探針制備兩種納豆激酶示蹤微膠囊[16]。其中,香豆素-6與多聚物按質量比1∶200溶解于乙酸乙酯/氯仿(v∶v=1∶1)中,其余步驟與1.2.1相同,制備所得香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊用于Caco-2吸收實驗。

1.2.4 微膠囊體外模擬緩釋 人體胃環境模擬[14]:分別將兩種納豆激酶微膠囊溶于Tris-HCl緩沖液(pH2.0),置于37 ℃搖床(50 r/min)中孵育2 h。分別于0.5、1和2 h時取出1 mL緩釋液,26475×g離心15 min,收集上清測定納豆激酶含量(M1),按下式計算納豆激酶微膠囊的釋放率:

釋放率(%)=(M1/M)×100,其中：M為微膠囊中納豆激酶初始質量。

人體腸道環境模擬:取上述酶解液,調節pH至7.0,并加入PBS緩沖液(pH7.0)至100 mL,置于37 ℃搖床中繼續孵育,并分別于2、3、5、9、12、15、18、21和24 h取1 mL上述反應液,測定納豆激酶含量并計算納豆激酶釋放率。

1.2.5 納豆激酶微膠囊細胞毒性評價 以Caco-2細胞存活率為指標,在樊佳新等[17]所建立的方法,采用MTT比色法對兩種納豆激酶微膠囊的細胞毒性進行評價。

1.2.6 Caco-2單層細胞模型的建立與評價

1.2.6.1 Caco-2單層細胞模型的建立 取對數期Caco-2細胞,按105個/孔分別接種于12孔的Transwell小室頂側(apical,AP)和基底側(basolateral,BL),加入1.5 mL DMEM培養基(10%胎牛血清);嚴格按照21 d培養規程,前兩周隔天更換培養基,之后每天更換培養基[18]。

1.2.6.2 Caco-2單層細胞模型評價 為評價Caco-2單層細胞模型建立效果,實驗以細胞跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance,TEER)、標志物(熒光素鈉)透過率和細胞極性(堿性磷酸酶活性)為指標,評價單層細胞模型的完整性及分化狀況。其中,采用跨膜電阻儀測定TEER值;按照袁秀妍等[19]方法,分別測定AP→BL和BL→AP兩個方向上熒光素鈉的累積透過率;采用堿性磷酸酶試劑盒分別測AP側和BL側堿性磷酸酶的活性,并計算兩側(AP/BL)的酶活比值。

1.2.7 Caco-2單層細胞轉運吸收實驗 轉運吸收實驗[20]:AP→BL方向,AP側加入0.5 mL相同濃度不同種類的香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊溶液,BL側分別加入1.5 mL HBSS緩沖液;BL→AP方向,AP側加入1.5 mL HBSS緩沖液;BL側分別加入0.5 mL相同濃度不同種類的香豆素-6示蹤納豆激酶微膠囊溶液。分別于培養30、60、120和180 min時收集AP、BL兩側反應液,采用分光光度法[21]測定其中香豆素-6的含量,計算AP→BL方向的頂側表觀滲透系數Papp(AP→BL)、BL→AP方向基底側表觀滲透系數Papp(BL→AP)及兩個方向上表觀滲透系數比值Papp(AP→BL)/Papp(BL→AP)。其中,表觀滲透系數(Papp)計算公式如下[22]:

式中,dQ/dT:單位時間內香豆素-6的透過量(μg/s);A:Transwell小室有效膜面積(cm2),本實驗所用12孔Transwell小室有效膜面積為1.12 cm2;Co:初始加入微膠囊中香豆素-6濃度(μg/mL)。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取 為更直觀的展示兩種向微膠囊在Caco-2單層細胞中的吸收分布情況,利用香豆素-6的熒光特性,采用活細胞超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡，對1.2.7中轉運180 min時的Caco-2單層細胞進行觀察,具體步驟為:轉運180 min后,棄去AP與BL兩側培養液,先用DPBS緩沖液多次沖洗兩側,并小心將單層細胞連同Transwell聚碳酸酯膜一同剝離后,AP側朝上平鋪在載玻片上,采用激光共聚焦顯微鏡進行觀察,條件:激發波長488 nm、掃描方式xyz、掃描速度400 Hz、光譜分光速度100 nm·ms-1。

1.3 數據處理

實驗結果采用SPSS 19軟件進行統計分析,p<0.05表示有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 正交試驗及微膠囊表征

以PEG-PLGA為壁材,以納豆激酶微膠囊的包封率為指標進行正交實驗設計,實驗結果如表2和表3所示。

表2 PEG-PLGA納豆激酶微膠囊制備的正交試驗設計與結果Table 2 Design and results of orthogonal experiment for nattokinase loaded PEG-PLGA microcapsules preparation

表3 納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細胞中轉運吸收結果Table 3 Transportation and absorption of nattokinase loaded microcapsules in Caco-2 cell

由表2中極差值(R)可知,影響納豆激酶微膠囊包封率大小的四個因素順序為:壁材濃度>PVA濃度>二級均質時間>二級均質轉速;由四個因素不同水平所對應的包封率大小可知,當壁材濃度、PVA濃度、二級均質轉速和二級均質時間分別取5 mg/mL、1%、17500 r/min和7.5 min時可得到最大包封率。

采用上述制備條件制得PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊,表征結果如下:包封率分別為61.54%±2.36%和58.76%±2.54%,平均粒徑分別為(271.33±7.1) nm和(255.75±3.3) nm,PDI分別為(0.263±0.023)和(0.231±0.014),ζ電位分別為(-20.17±1.42)和(-24.73±2.36) mV。與采用傳統壁材阿拉伯膠和明膠[6]所制備納豆激酶微膠囊相比,本實驗所制備的兩種納豆激酶微膠囊粒徑為納米級,這一性質可能賦予微膠囊進入血液循環的功能[23]。兩種微膠囊納豆激酶包封率較高,分散性良好,且采用優化后參數制備所得兩種微膠囊各項表征參數無明顯差異。

2.2 微膠囊體外模擬緩釋

微膠囊體外模擬緩釋結果如圖1所示。2 h時,PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA微膠囊兩種微膠囊的納豆激酶累積釋放率分別為36.2%±3.2%和39.3%±3.9%;在腸道環境中,兩種微膠囊的納豆激酶累積釋放率均增加緩慢,24 h時,兩微膠囊的累積釋放率分別為71.7%±3.8%和78.6%±2.9%,兩者的緩釋率變化趨勢一致。Jain等[14]制備了PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種胰島素微膠囊,0～2 h(pH1.6),累積釋放率分別為37%±2.86%和40%±2.46%,24 h時累積釋放率分別為52%±3.51%和56%±3.17%,與之相比,本實驗制備的微膠囊在胃環境中釋放率相差不大,但在腸道環境具有更高的釋放率,即有更好的腸溶效果。綜合分析,兩種微膠囊在胃環境中2 h納豆激酶的釋放率均小于40%,即納豆激酶仍有超60%被完整保留下來進入腸道環境,且在腸道環境下表現出一定的緩釋效果,因而除葉酸靶向及納米促吸收外,還有望通過延長吸收時間而提高吸收量[24]。

圖1 兩種納豆激酶微膠囊在體外模擬胃腸環境中的釋放Fig.1 Gastrointestinal release curve in vitro of two kinds of nattokinase loaded microcapsules

2.3 MTT法評估納豆激酶微膠囊的細胞毒性

兩種微膠囊的細胞毒性結果如圖2所示,由圖可知當濃度小于500 μg/mL時,Caco-2細胞存活率均高于98%,且各組間無顯著差異;當濃度為750 μg/mL時,PEG-PLGA納豆激酶微膠囊實驗組的細胞存活率顯著下降(p<0.05),說明此濃度下,PEG-PLGA納豆激酶微膠囊對Caco-2細胞有一定的細胞損傷;而使細胞存活率顯著(p<0.05)下降的FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊濃度為1000 μg/mL。所有實驗組的細胞存活率均大于85%,細胞毒性分級為0或1級,即兩種微膠囊無細胞毒性[26]。根據實驗結果,選擇不引起明顯細胞損傷的500 μg/mL為兩種微膠囊的最高添加量,并用于后續轉運吸收實驗中。

圖2 兩種納豆激酶微膠囊對Caco-2細胞存活率的影響Fig.2 Effects of two kinds of nattokinase loaded microcapsules on the survival rate of Caco-2 cell注:不同小寫字母表示差異性顯著(p<0.05)。

2.4 Caco-2單層細胞模型建立與評價

經21 d培養后，分別對Caco-2單層細胞模型的TEER值、堿性磷酸酶活性、熒光素鈉透過率進行測定。一般認為，單層細胞TEER值在200～1000 Ω·cm2之間，即認為所建立的細胞具有良好的完整性[26]。TEER值及極性分化測定結果如圖3所示。培養前期，TEER值無明顯變化，從第6 d至第11 d，TEER值迅速從83.6 Ω·cm2增大至約600 Ω·cm2，從第12 d開始，TEER值增速減緩并最終穩定在750 Ω·cm2左右，說明Caco-2單層細胞完整性良好。此外，隨著培養時間延長，AP、BL兩側堿性磷酸酶活力比逐漸增大，21 d時達11.8，說明Caco-2單層細胞出現極性分化現象。

圖3 Caco-2單層細胞模型TEER值變化及AP、BL兩側堿性磷酸酶酶活比值變化Fig.3 Change of TEER and ratio of alkaline phosphatase enzyme activity(AP and BL)in Caco-2 monolayer cells

轉運2.5 h后，若AP→BL和BL→AP兩個方向上熒光素鈉的累積透過率均不超過1%，即可認為單層細胞的完整性和緊密性良好，所建單層細胞模型可用于轉運吸收實驗。熒光素鈉透過率測定結果如圖4所示，實驗結果表明，AP→BL方向上，2.5 h熒光素的累積透過率不超過1%，BL→AP方向上，2.5 h的累積透過率不超過0.1%，說明單層細胞之間連接緊密。

圖4 熒光素鈉透過率Fig.4 Sodium fluorescein transmittance

綜合評價,本實驗培養的Caco-2單層細胞之間連接緊密,具有良好的致密性和完整性,且已極性分化,可用于跨膜轉運吸收實驗。

2.5 Caco-2單層細胞轉運吸收實驗

一般認為,Papp>1.0×10-5cm/s表明物質在人體中能夠被完全吸收,Papp在0.1×10-6～1.0×10-6cm/s之間,物質的吸收率為1%～100%,當Papp≤1.0×10-7cm/s時,即可視為物質不能被吸收[27];若兩個方向上Papp比值Papp(AP→BL)/Papp(BL→AP)在0.5～2.0之間,則表明物質轉運吸收機制主要為被動轉運[28]。

PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細胞中轉運吸收實驗結果如表3所示。由表3可知,在AP→BL方向上,兩種納豆激酶微膠囊的頂側表觀滲透系數Papp(AP→BL)均大于1.0×10-6cm/s,最高分別可達2.367×10-6和3.497×10-6cm/s,說明Caco-2單層細胞對兩種微膠囊均有很高的吸收率,可能是由于微膠囊為納米級,且良好的生物相容性,從而促進了納豆激酶微膠囊在小腸細胞中吸收[29];相同的轉運時間,FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的Papp(AP→BL)均顯著(p<0.05)高于PEG-PLGA微膠囊,說明前者在Caco-2單層細胞中具有更高的吸收率,推測可能是壁材FA-PEG-PLGA中的葉酸分子與Caco-2細胞表面的葉酸受體結合而將微膠囊內吞進入細胞,從而促進跨膜轉運作用[30]。隨著時間的延長,PEG-PLGA微膠囊Papp(AP→BL)未出現明顯的變化,且兩側Papp比值Papp(AP→BL)/Papp(BL→AP)穩定在1.4～1.5之間,由此推測該種微膠囊的轉運吸收方式主要為被動轉運。隨著時間的延長,FA-PEG-PLGA微膠囊的Papp(AP→BL)值逐漸降低,且兩個方向上的Papp比值從0.757減小至0.495,由此推測轉運吸收過程除了被動轉運之外,還可能存在P-糖蛋白等介導的外排機制[31],也可能是因為葉酸受體與葉酸的結合作用趨于飽和,從而導致比值下降。

2.6 激光共聚焦觀察Caco-2細胞對微膠囊的攝取

采用激光共聚焦顯微鏡觀察Caco-2單層細胞吸收兩種納豆激酶微膠囊后示蹤劑香豆素-6的分布情況,結果如圖5和圖6所示。白光掃描結果顯示,細胞表面均完整且無明顯凸起或凹陷,說明細胞完整性良好;488 nm波長掃描結果顯示,熒光主要分布在細胞之間與細胞邊緣,且FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊在Caco-2細胞中熒光強度及分布范圍明顯大于PEG-PLGA納豆激酶微膠囊,這一結果與2.5中FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的Papp(AP→BL)顯著高于PEG-PLGA納豆激酶微膠囊的結果一致。

圖5 香豆素-6示蹤PEG-PLGA納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細胞中吸收情況的激光共聚焦顯微鏡觀察圖Fig.5 LSCM observation of coumarin-6 traced PEG-PLGA nattokinase microcapsules absorbed in Caco-2 monolayer cells注:a:白光;b:488 nm。

圖6 香豆素-6示蹤FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊在Caco-2單層細胞中吸收情況的激光共聚焦顯微鏡觀察圖Fig.6 LSCM observation of coumarin-6 traced FA-PEG-PLGA nattokinase microcapsules absorbed in Caco-2 monolayer cells注:a:白光;b:488 nm。

綜上,細胞吸收實驗結果表明,Caco-2單層細胞對兩種微膠囊均有很好的吸收,其中對PEG-PLGA微膠囊的吸收方式主要是被動擴散,對于FA-PEG-PLGA微膠囊的吸收方式除被動擴散之外還可能存在主動轉運方式,因而表現出更高的吸收效果,但是否是由葉酸與Caco-2細胞表面的葉酸受體結合而促進吸收,以及是否存在P-糖蛋白等介導的外排作用均有待進一步研究。

3 結論

本實驗以PEG-PLGA為壁材,通過正交試驗確定PEG-PLGA納豆激酶微膠囊雙重乳液蒸發法制備的最適條件為:壁材濃度5 mg/mL、PVA濃度1%、二級均質轉速17500 r/min、二級均質時間7.5 min;在此條件下制備的PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種納米級納豆激酶微膠囊的平均粒徑分別為(271.33±7.1)和(255.75±3.3) nm,包封率分別為61.54%±2.36%和58.76%±2.54%,并以香豆素-6為熒光探針制備得PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA兩種香豆素-6示蹤的納豆激酶微膠囊;兩膠囊的體外模擬釋放結果表明在胃環境中2 h,納豆激酶仍有超60%不被釋放,且在腸道環境下表現出一定的緩釋效果。兩種微膠囊對Caco-2細胞均無明顯細胞毒性;兩種微膠囊在Caco-2細胞中的Papp(AP→BL)均大于2.0×10-6cm/s,激光共聚焦顯微鏡觀察結果同樣顯示兩者吸收良好,且FA-PEG-PLGA納豆激酶微膠囊具有更好的吸收,但FA-PEG-PLGA是否存在葉酸受體介導的轉運尚有待進一步研究。

綜上,PEG-PLGA和FA-PEG-PLGA均可用于納米級納豆激酶微膠囊的制備,具有胃環境保護及腸道緩釋作用,無明顯細胞毒副作用,細胞吸收效果良好,本實驗為通過葉酸靶向作用促進納豆激酶的細胞吸收研究提供了依據。