3種殺菌處理對炭黑曲霉生長和赭曲霉毒素A產生量的影響

彭青枝,楊冰潔,王璐榮,楊書珍,朱曉玲

(1.湖北省食品質量安全監督檢驗研究院,湖北武漢 430070; 2.華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070)

炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)屬于曲霉屬黑色曲霉菌,能夠侵染葡萄、谷物、咖啡、可可和花生等食品原料[1],其中從葡萄中分離得到的炭黑曲霉數量最多[2]。炭黑曲霉不僅是引起葡萄果實腐爛變質的腐敗菌,同時也是葡萄中真菌毒素赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的主要產生菌,廣泛存在于許多國家和地區的葡萄及其制品中,是造成葡萄酒中OTA污染的主要來源。OTA是自然界中最常見、毒素最強的真菌毒素之一,對人類和動物有致畸[3]、致癌[4]、致突變[5]的風險,嚴重威脅了人類的健康,被國際癌癥研究機構歸為2B致癌物[6]。因此,尋找控制炭黑曲霉污染的有效措施對于新鮮果實原料及其制品的安全生產具有重要意義。

真菌生長及其毒素產生受物理、化學和生物等多方面因素的影響。目前果蔬采后生產中主要通過物理和化學途徑來控制病原真菌的發生。溫度處理、紫外處理和化學保鮮劑等方法對果蔬采后真菌病害具有良好的控制效果,被廣泛應用于蘋果、葡萄和楊梅等果蔬的采后殺菌保鮮[7-8]。適宜的溫度處理能夠有效控制采后病原微生物的生長和果蔬采后呼吸作用,延長果蔬采后壽命,被廣泛應用于菠菜、楊梅等的采后保鮮[9]。紫外線照射通過穿透微生物的細胞膜,導致微生物繁殖力降低或死亡[10-11],被作為綠色、安全的果蔬保鮮殺菌技術廣泛應用于蘋果、櫻桃、葡萄、檸檬等果實的采后殺菌保鮮[12]?；瘜W殺菌處理由于操作方便、成本低廉、效果顯著,被廣泛應用于果蔬采后真菌病害的控制[13]。其中,多菌靈、抑霉唑和咪鮮胺對于采后病原真菌具有廣譜的殺菌效果,在果蔬采后貯藏過程中廣泛使用,但有關這些殺菌劑處理對采后病原真菌毒素產生的相關報道鮮見[14-15]。Medina等[16]研究發現中等濃度的多菌靈處理雖然能夠顯著抑制炭黑曲霉的生長,但卻促進了OTA的大量產生;史祥鵬等[17]也發現溫度處理對梨樹腐爛病菌黑腐皮殼菌的生長和真菌毒素產生的影響并不一致。以上研究結果表明,如果采后殺菌處理使用不當,很有可能會刺激真菌毒素的大量產生,進而影響果蔬采后的安全貯藏與加工[18-19]。但目前有關采后殺菌處理對病原真菌產生毒素影響的報道鮮見。因此,本文擬果蔬采后常見產毒病原真菌炭黑曲霉為對象,研究常見的采后殺菌處理(溫度處理、紫外照射處理、化學殺菌劑處理)對炭黑曲霉生長和真菌毒素OTA產生的影響,以期為果蔬采后貯藏和加工過程中真菌毒素的有效控制提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌株炭黑曲霉(CICC 40296)從葡萄上分離 購自中國工業微生物菌種保藏中心,菌株用察氏培養基于25 ℃培養箱中培養,并在4 ℃條件下保存待用;硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂、乙腈、乙酸、無水硫酸鎂、氯化鈉、甲酸等 其中甲酸為色譜純,其余均為分析純,國藥集團化學制劑有限公司。

EX20顯微鏡 寧波舜玉儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-18SI 上海博訊實業有限公司;高效液相色譜儀3000 賽默飛世爾科技;質譜儀Sciex Triple QuadTM6500 美國Abel公司;色譜柱Acquity UPLC BEH C18 Waters公司;氮吹儀DCY-12B 金昌公司;

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子菌懸液的制備 炭黑曲霉菌在察氏培養基平板上于25 ℃下培養6 d,待充分產孢后,用含吐溫-80溶液10 mL輕輕洗下孢子,然后用3層無菌紗布過濾除掉菌絲,得到孢子菌懸液;然后再用無菌水調節菌懸液濃度為1×106個/mL備用。

1.2.2 孢子萌發試驗 將察氏培養基涂布于已滅菌的載玻片上,待培養基充分凝固后,吸取40 μL孢子菌懸液接種在察氏培養基上,然后將載玻片放置在培養皿(底部鋪一層吸水濾紙)中,置于25 ℃恒溫培養箱中培養。每個處理設3次重復。培養7 h后觀察孢子萌發情況,并按下列公式計算孢子萌發率和不同處理對孢子萌發的抑制率。

1.2.3 菌絲生長試驗 將12 mL察氏固體培養基加入到直徑7 cm培養皿中,待培養基充分凝固后,取4 μL菌懸液接種于培養基的正中央,然后置于25 ℃恒溫培養箱中,培養5 d時,測量菌落直徑。每個處理設3次重復。

1.2.4 炭黑曲霉 OTA的含量測定 將12 mL察氏固體培養基倒入至直徑7 cm培養皿中,待充分凝固后,取50 μL菌懸液涂布在培養基上,然后放置于25 ℃恒溫培養箱中培養7 d,取緊貼菌絲底部的培養基用于檢測OTA含量;每個處理做3個重復,結果取平均值。OTA的含量測定采用超高效液相串聯質譜(UPLC-MS)的方法進行,毒素提取和檢測條件如下:

1.2.4.1 OTA的提取 準確稱取培養7 d的察氏固體培養基5 g于具塞離心管中,加入10 mL 1%(v/v)乙酸的乙腈和10 ml超純水,將所得溶液漩渦振蕩提取30 min,加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉,輕輕振蕩1 min,在4000 r/min的轉速下離心5 min,取上清液8 mL于40 ℃下氮吹至近干,殘余物質用1 mL 70%(v/v)甲醇水復溶,過0.22 μm微孔濾膜,濾液經 UPLC-MS/MS測定。

1.2.4.2 OTA檢測 超高效液相串聯質譜條件:采用電噴霧離子源,正離子模式(ESI+),質譜掃描方式:多反應監測(MRM),電離電壓3 kV,離子源溫度120 ℃,脫溶劑溫度380 ℃,脫溶劑氣流量800 L/h,碰撞氣流量0.18 L/min,錐孔反吹氣流量50 L/h,離子對404.2/239,錐孔電壓70 V,碰撞電壓32 V。

1.2.5 采后殺菌處理條件

1.2.5.1 紫外殺菌 分別將接種炭黑曲霉菌懸液的察氏培養基平板,放置在光強為60 Lux的紫外光下照射0、15、30、45、60和75 min;以未照光處理為對照。然后按本文1.2.2,1.2.3,1.2.4中的方法進行孢子萌發、菌絲生長和OTA產生的評價。

1.2.5.2 溫度處理 將接種了炭黑曲霉菌懸液的察氏培養基平板分別放置在4、15、20、25、30、35 ℃溫度下培養,以25 ℃下培養為對照。然后按本文1.2.2,1.2.3,1.2.4中的方法進行孢子萌發、菌絲生長和OTA產生的評價。

1.2.5.3 化學殺菌劑處理 分別將抑霉唑、多菌靈和抑霉唑加入察氏培養基中,采用對倍稀釋法稀釋,使抑霉唑濃度0、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μg/mL,咪鮮胺濃度為0、0.06、0.12、0.24、0.48、0.96 μg/mL,多菌靈濃度0、0.24、0.48、0.96、1.92、2.84 μg/mL,以不加藥的察氏培養基作為對照。然后按本文1.2.2,1.2.3,1.2.4中的方法進行孢子萌發、菌絲生長和OTA產生的評價。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件對實驗數據進行整理繪圖,用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析,數據結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 紫外處理對炭黑曲霉生長及OTA產生量的影響

本試驗研究了不同紫外照射時間對炭黑曲霉生長和真菌毒素OTA產生的影響。由圖1可知,紫外照射處理可以抑制炭黑曲霉的生長,且抑菌效果隨紫外照射時間延長而提高,照射75 min時,孢子萌發率和菌落生長直徑分別為35.39%和1.7 cm,顯著低于未經紫外照射處理的真菌孢子萌發率和菌落直徑(91.32%和5.2 cm)。表明紫外照射能夠抑制炭黑曲霉的生長。有研究證明紫外照射能夠抑制黃曲霉菌的生長,且隨著照射時間的延長抑制率增加[20-21]。紫外線能夠抑制真菌生長主要是由于破壞了微生物的DNA的結構,引發突變,使細胞的遺傳活性喪失,從而真菌生長受到抑制[22]。但本試驗研究發現,紫外照射后炭黑曲霉的產毒規律與生長規律并不一致。當紫外照射時間為45 min時,OTA的產生量最多,達到14.48 ng/g,是對照組的3.18倍,之后OTA的產生量隨著照射時間的延長而下降。Ribeiro等[23]也發現,一定強度的γ射線處理刺激了黃曲霉和赭曲霉產生大量的真菌毒素,推測可能與γ射線處理使真菌處于一定的脅迫條件有關。因此,在本試驗中,中等時間的紫外處理可能使炭黑曲霉處于脅迫狀態,進而刺激了炭黑曲霉產生大量包括OTA在內的次生代謝物質,以增強機體的防御能力。但長時間的紫外處理會抑制甚至殺死炭黑曲霉,降低了炭黑曲霉的代謝活性,從而使OTA的產生量下降。

圖1 紫外照射對炭黑曲霉生長和毒素產生的影響Fig.1 Effects of ultraviolet light irradiation on grow and toxins of A. carbonarius

2.2 溫度處理對炭黑曲霉生長及毒素產生量的影響

本試驗研究了不同培養溫度對炭黑曲霉的生長和OTA產生的影響。從圖2中看出,培養溫度對炭黑曲霉的孢子萌發和菌落直徑生長有明顯的影響。4 ℃時,炭黑曲霉的生長被完全抑制;在4～25 ℃的范圍內,隨著溫度的升高,孢子萌發和菌落直徑都呈現上升趨勢,在25 ℃的條件下炭黑曲霉的孢子萌發率和菌落直徑達最大,分別為89.80%和5.51 cm。之后隨著溫度升高菌落生長和孢子萌發會受到抑制,尤其在35 ℃下真菌生長受到強烈抑制,孢子萌發率和菌落生長直徑分別下降至69.12%和4.45 cm。

圖2 溫度處理對炭黑曲霉生長和OTA產生的影響Fig.2 Effects of culture temperature on grow and toxins of A. carbonarius

溫度對炭黑曲霉產生OTA的影響與其對菌體生長的影響相似。4 ℃時,培養基中未檢出OTA;在4～25 ℃的范圍內,隨著溫度的升高,OTA產生量也增加,25 ℃時OTA產生量最高,達到10.91 ng/g。當溫度高于30 ℃時,隨著炭黑曲霉的生長受到抑制,OTA產生量也大幅度下降。Oviedo等[24-25]在研究溫度對大豆中鏈格孢菌生長與真菌毒素產生的影響時,也發現溫度對鏈格孢菌生長的影響規律與對毒素產生的影響規律相一致,低溫和高溫均不利于鏈格孢菌的生長和毒素的產生。Pose等[26]發現低溫(6 ℃)和高溫(35 ℃)均能顯著抑制鏈格孢菌在番茄合成培養基中的生長和鏈格孢毒素的產生,并認為低溫有利于番茄制品的安全貯藏。因此,低溫貯藏和高溫處理是抑制炭黑曲霉生長和降低OTA產生的有效措施。

2.3 采后化學殺菌劑處理對炭黑曲霉生長和OTA產生的影響

化學殺菌劑通過抑制生物合成途徑中的酶活性,阻礙麥角甾醇的合成,導致真菌細胞膜結構破壞和細胞死亡[27]。本試驗中研究了抑霉唑、多菌靈、咪鮮胺3種常用化學殺菌劑對炭黑曲霉生長和OTA產生的影響。由圖3可以看出,所測試的多菌靈、抑霉唑、咪鮮胺對炭黑曲霉的菌落生長和孢子萌發均表現出較強的抑制作用,并呈濃度效應。多菌靈、抑霉唑、咪鮮胺分別在0.48、0.48和 0.96 μg/mL時,能夠完全抑制炭黑曲霉的孢子萌發和菌絲體生長。而3種殺菌劑處理在低于最低抑菌濃度的條件下對OTA的產生具有顯著的促進作用,并且隨著殺菌劑處理濃度的增加,OTA的產生量出現先增加后下降的趨勢。多菌靈的濃度為0.12 μg/mL時OTA的產生量最大,達到12.24 ng/g,是對照的6.31倍,抑霉唑和咪鮮胺在0.06 μg/mL時的產生量最大,OTA的產生量達到10.62 ng/g和18.14 ng/g,是對照組的23.7倍和6.17倍。以上結果表明常見采后殺菌劑多菌靈、抑霉唑、咪鮮胺雖然在低濃度和中等濃度下能夠抑制炭黑曲霉的生長,但卻刺激了真菌毒素OTA的大量產生。張艷軍等[27]在研究嘧菌酯或多菌靈對禾谷鐮孢菌的影響時,也發現了類似的現象。有些化學殺菌劑對病原真菌毒素的產生確實存在低濃度促進、高濃度抑制的現象。這些現象可能與化學殺菌劑的長期使用強化了病原真菌的防御系統,通過分泌真菌毒素增強機體的抗藥性有關[28-29]。Terra等[30]發現大多數普遍使用的化學殺菌劑只有在生產商推薦的藥劑使用劑量和條件下才能達到效果;殺菌劑的種類、劑量和環境溫度是影響殺菌劑抑制病原菌生長和OTA產生的關鍵因素。因此,果蔬采后進行化學殺菌處理時,準確評價化學殺菌劑的安全抑菌濃度對于減少真菌毒素的積累具有重要意義。

圖3 多菌靈處理對炭黑曲霉孢子萌發、菌絲生長和OTA產生的影響Fig.3 Effect of carbendazim treatment on spore germination,mycelial growth and OTA production

圖4 抑霉唑處理對炭黑曲霉孢子萌發、菌絲生長和OTA產生的影響Fig.4 Effect of imazalil treatment on spore germination,mycelial growth and OTA production

圖5 咪鮮胺處理對炭黑曲霉孢子萌發、菌絲生長和OTA產生的影響Fig.5 Effect of prochloraz treatment on spore germination,mycelial growth and OTA production

3 結論

采后殺菌處理如紫外處理、溫度處理(0～35 ℃)和化學殺菌劑多菌靈、抑霉唑和咪鮮胺處理對炭黑曲霉的生長均表現強烈的抑制作用,但對于OTA產生卻表現出不同的影響。較短時間的紫外照射處理(紫外強度60 Lux,處理時間為45 min)或中等劑量的化學殺菌劑處理(多菌靈,0.96 μg/mL;抑霉唑和咪鮮胺,0.06 μg/mL)會刺激OTA的大量產生。而炭黑曲霉的最適生長溫度與OTA最適產生溫度相一致。因此,合理的貯藏溫度和殺菌處理條件對于采后果蔬的安全生產具有十分重要的作用。