靈芝三萜酸改善小鼠睡眠作用研究

俞 盈,吳學謙,熊科輝,包國良,許海順,徐 娟,吳慶其,李青青,么春艷

(浙江省醫學科學院,保健食品研究所,浙江杭州 310013)

睡眠是人類和高等動物必須的生理過程,是維持體力和健康的基礎。失眠是一種常見的睡眠障礙,指不能入睡或不能維持睡眠狀態[1]。慢性失眠的發病率大概為15%[2],短暫性失眠的發病率約為80%[3]。目前對于失眠的治療以服用人工合成藥物為主,然而合成藥物存在嚴重的藥物依賴、認知和運動損害、停藥反跳性失眠等不良反應。因此,亟需尋找發展安全有效的鎮靜安神藥物,以突破鎮靜安神藥物和飲食補充劑的發展瓶頸。

靈芝為多孔菌科赤芝[Ganodermalucidum(Leyss. ex. Fr.)Karst.]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子實體,自古就有“仙草”、“瑞草”之稱,藥用價值極高,是我國珍貴的菌藻類藥材。我國人民把它作為藥用已有2000多年的歷史,周朝古籍《列子》一書中就有“朽壤之上,有菌者芝”。靈芝的“安神”作用始載于《神農本草經》,2005年版《浙江省中藥飲片炮制規范》和2010年版《中華人民共和國藥典》均記述了靈芝具有“益氣安神”作用。

在靈芝的多種活性成分中,水溶性的靈芝多糖和醇溶性的三萜類化合物是主要生物活性成分,其含量高低是衡量靈芝藥用價值和品質的重要指標。靈芝多糖一直作為靈芝的主要有效成分,關于靈芝多糖改善睡眠的動物實驗研究較多[4-9],也有一些科學研究涉及作用機制及人體試食[10-11],但研究結果并不一致。近年來,靈芝三萜酸作為靈芝的特有成分而備受關注。國內外關于靈芝三萜酸的研究以優化其提取工藝及含量檢測居多[12],運用現代藥理方法研究靈芝三萜酸鎮靜安神作用的研究報道并不多見。Cho等[13]應用放射性配體受體結合實驗,體外實驗證明靈芝子實體醇提物γ-氨基丁酸A(GABAA)受體有中等強度親和力,其可能通過GABAA受體改善睡眠,但并未進一步在動物體內驗證其藥理作用。賈薇等[4]研究發現靈芝三萜與茯苓提取物有協同改善睡眠的功能,但作用機制不明確。其他相關研究未見報道,因此,本實驗研究通過直接睡眠實驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗研究了靈芝三萜酸的鎮靜安神作用,為靈芝子實體相關的食品及保健食品研發提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠,清潔級健康,體重18～22 g,雄性,50只,浙江省醫學科學院實驗動物中心提供,實驗動物生產證許可證號SCXK(浙)2014-0001;赤靈芝子實體 由浙江五養堂藥業有限公司提供,產地為浙江五養堂原木靈芝栽培基地,于每年10月進行采摘,65 ℃烘箱干燥12 h,粉碎,過 60目篩備用;95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、NaOH、HCl、冰乙酸、高氯酸、香草醛、吐溫80 均為分析純;齊墩果酸 純度≥98%,中國食品藥品檢定研究院;地西泮(Diazepam) Aladdin公司;戊巴比妥鈉、巴比妥鈉 Merck公司。

UV-3802型紫外分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;FB224電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RV10旋轉蒸發儀 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝三萜酸的制備及測定 靈芝粗三萜酸的制備及精制參考文獻[14],略有修改:赤芝子實體精粉(過60目篩)100 g,95%乙醇20倍量超聲提取2次,超聲頻率40 kHz,每次30 min,合并提取液,真空旋轉蒸發干燥。所得浸膏重溶于水,用石油醚除脂,乙酸乙酯萃取3次,所得乙酸乙酯部分旋蒸干燥。將旋蒸干燥的乙酸乙酯部分重溶于乙酸乙酯,堿化至pH9～10,水洗至中性,將萃取得到的堿化水層酸化至pH2～3,用乙酸乙酯萃取3次得到粗靈芝三萜酸部分,將靈芝三萜酸部分旋蒸干燥即為含量測定及實驗動物灌胃用樣品。

靈芝三萜酸含量的測定方法參見文獻[15],略作修改:靈芝三萜酸樣品0.24 g置于容量瓶中,加入乙酸乙酯溶解,超聲振動溶解,過濾定容至50 mL,用香草醛-高氯酸顯色反應測定靈芝三萜酸的含量。樣品于548 nm處測定吸收值,以吸光值為縱坐標,以齊墩果酸含量為橫坐標作標準曲線,得出回歸方程,并計算受試物靈芝三萜酸的含量。

1.2.2 小鼠體重測定實驗 ICR小鼠飼養于浙江省醫學科學院實驗動物中心SPF級動物房,溫度為22～25 ℃,相對濕度為40%～70%,光照-黑暗循環為12 h∶12 h,自由飲水攝食。動物實驗通過本單位實驗動物倫理委員會批準。實驗開始前,稱量實驗小鼠初始體重,并根據小鼠體重分為5組,分別是溶劑對照組(5% 吐溫80,10 mL/kg·bw)、陽性對照組(地西泮,2.5 mg/kg·bw)、靈芝三萜酸低劑量組(25 mg/kg·bw)、中劑量組(50 mg/kg·bw)、高劑量組(100 mg/kg·bw),每組10只。各組動物每天灌胃1次,連續灌胃30 d,每周于灌胃結束后稱取小鼠體重1次。

1.2.3 直接睡眠實驗 各組動物每天分別給予相應的受試物,觀察灌胃后30 min內,小鼠是否出現睡眠現象,以動物的翻正反射消失超過60 s判為進入睡眠,翻正反射恢復即為動物覺醒[16]。比較溶劑對照組、靈芝三萜酸各劑量組對小鼠直接催眠的影響。

1.2.4 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗 在戊巴比妥鈉催眠的基礎上,觀察各受試物是否延長睡眠時間,若睡眠時間延長,則說明受試物與戊巴比妥鈉有協同作用[16]。各組小鼠每天給予靈芝三萜酸1次,連續30 d,于末次給予前12 h禁食不禁水。末次灌胃60 min后,各組小鼠給予48 mg/kg·bw戊巴比妥鈉(i.p.),注射量為0.1 mL/10 g·bw。以小鼠的翻正反射消失60 s以上作為入睡判斷標準,以動物注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失的時間作為睡眠潛伏期,動物翻正反射消失到恢復這段時間為動物睡眠時間,比較各受試物能否縮短戊巴比妥鈉注射小鼠的入睡潛伏期,延長睡眠時間。

1.2.5 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 各組小鼠每天給予靈芝三萜酸1次,連續30 d,于末次給藥予12 h禁食不禁水。在末次灌胃60 min后,各組動物(i.p.)給予32 mg/kg·bw戊巴比妥鈉,注射量為0.1 mL/10 g·bw,以小鼠的翻正反射消失達60 s以上作為入睡判斷標準,記錄30 min內各組入睡動物數并計算睡眠發生率。睡眠發生率(%)=(入睡動物數/每組動物數)×100[14]。

1.2.6 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 在巴比妥鈉催眠的基礎上,觀察受試物是否能夠縮短動物的入睡潛伏期,若潛伏期縮短,則說明受試物與巴比妥鈉有協同作用[16]。各組小鼠每天給予靈芝三萜酸1次,連續30 d,于末次給藥予12 h禁食不禁水。各劑量組在末次灌胃60 min后,各組動物按280 mg/kg·bw給予巴比妥鈉(i.p.),注射量為0.1 mL/10 g·bw,以小鼠翻正反射消失60 s以上作為入睡指標,從注射巴比妥鈉到動物入睡即為睡眠潛伏期,觀察各組受試物能否縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 靈芝三萜酸的含量

靈芝三萜酸經過提取及初步精制,去除脂肪酸等小極性化合物產生的干擾,以吸光值為縱坐標,以齊墩果酸含量為橫坐標,得到回歸方程y=9.7202x+0.0033,r=0.9997。根據回歸方程計算得出受試物靈芝三萜酸的含量為11.49%。

2.2 靈芝三萜酸對小鼠體重的影響

靈芝三萜酸25、50、100 mg/kg劑量組的實驗小鼠初始體重與溶劑對照組(吐溫80)和陽性對照組(地西泮)比較差異均不顯著(p>0.05)(表1),連續灌胃給予受試物30 d后,靈芝三萜酸各劑量組實驗小鼠體重與溶劑對照組和陽性對照組均沒有顯著性差異(p>0.05)(表1),表明靈芝三萜酸對小鼠體重無明顯影響,在本實驗設計劑量下對小鼠體重未顯示出明顯的不良作用。

表1 靈芝三萜酸對小鼠體重的影響(n=10)Table 1 Effect of triterpene acids of G. lucidum on body weight of mice(n=10)

2.3 靈芝三萜酸對直接睡眠的影響

各組小鼠在給予受試物60 min內,通過實驗觀察,靈芝三萜酸組和溶劑對照組均未有直接睡眠現象發生,即靈芝三萜酸及對照溶劑對小鼠均無直接催眠作用,推測其與其他藥物協同使用產生的中樞鎮靜作用可能是其改善小鼠睡眠的主要作用機制。

2.4 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉誘導睡眠時間的影響

按照《保健食品檢驗與評價技術規范》對靈芝三萜酸進行延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗,研究其對小鼠睡眠時間的影響。在戊巴比妥鈉催眠的基礎上,若睡眠時間延長,則說明受試物與戊巴比妥鈉有協同作用[16]。結果見圖1A,陽性對照組小鼠的睡眠潛伏期(237.08±14.37) s極顯著低于溶劑對照組(297.14±22.62) s(p<0.01),靈芝三萜酸低、中、高劑量組小鼠睡眠潛伏期隨劑量縮短,分別為(260.87±16.67)、(250.24±55.57)、(252.73±36.43) s;靈芝三萜酸50和100 mg/kg組與溶劑對照相比均差異顯著(p<0.05),而靈芝三萜酸25 mg/kg組與溶劑對照組相比,其睡眠潛伏期降低12.21%,但不具有顯著性差異(p>0.05)。說明靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉具有協同作用,50和100 mg/kg劑量與一定劑量戊巴比妥鈉聯合作用能夠縮短小鼠的入睡時間。

實驗小鼠的睡眠時間結果見圖1B,靈芝三萜酸25、50、100 mg/kg劑量組的睡眠時間為(2474.86±755.91)、(2941.43±587.57)、(3541.25±500.67) s,與溶劑對照組(1554.14±395.64) s比較,靈芝三萜酸各劑量組小鼠睡眠時間分別延長59.24%、89.26%、127.86%,均具有極顯著差異(p<0.01),且隨著劑量增加睡眠時間增長。陽性對照組地西泮的睡眠時間為(3346.67±537.96) s,睡眠時間延長115.34%,與溶劑對照組相比差異極顯著(p<0.01)。靈芝三萜酸高劑量組100 mg/kg的睡眠時間強于陽性對照組。說明一定劑量的靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉有協同作用,可以極顯著(p<0.01)縮短小鼠的睡眠潛伏期并延長小鼠睡眠時間。

圖1 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉誘導睡眠時間的影響(n=10)Fig.1 Effect of G. lucidum triterpene acids on pentobarbital-induced mice(n=10)注:A:靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉致睡眠小鼠睡眠潛伏期的影響;B:靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉致睡眠小鼠睡眠時間的影響;*:與溶劑對照組比較差異顯著,p<0.05;**:與溶劑對照組比較差異極顯著,p<0.01；圖2、表2同。

目前國內外文獻未見單獨對靈芝三萜酸進行睡眠作用研究的相關報道。在靈芝水提物方面,Chu等[5]報道40 mg/kg的靈芝水提物與戊巴比妥鈉協同后,與空白對照組相比,未能顯著延長大鼠睡眠時間;80和120 mg/kg劑量的靈芝水提物與對照組相比,睡眠時間延長了50%和60%左右。本實驗研究結果提示,與空白對照組相比,靈芝三萜酸50和100 mg/kg的睡眠時間分別延長89.26%和127.86%?；具@一對比數據,靈芝三萜酸改善睡眠的作用效果優于靈芝水提物。

2.5 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗的影響

對靈芝三萜酸進行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗,研究其對小鼠睡眠發生率的影響。由于戊巴比妥鈉通過肝酶代謝,而對該酶有抑制作用的藥物,也能延長戊巴比妥鈉睡眠時間。為了排除這種影響,降低戊巴比妥鈉的劑量,進行閾下催眠實驗[16]。結果見表2。從實驗結果可以看出,靈芝三萜酸低、中、高劑量組的睡眠發生率分別為30%、50%、80%,均高于溶劑對照組的睡眠發生率(20%),且隨著受試物劑量的增加,睡眠發生率逐漸增加;靈芝三萜酸高劑量組100 mg/kg的睡眠發生率(80%)高于陽性藥物地西泮(60%)。與溶劑對照組相比,靈芝三萜酸25、50 mg/kg、地西泮組的睡眠發生率增加卻不具有顯著性差異(p>0.05),靈芝三萜酸100 mg/kg組與溶劑對照組相比顯著差異(p<0.05)。以上結果表明,靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉的協同睡眠作用并非通過影響戊巴比妥鈉的代謝過程而實現的。同時,其與戊巴比妥鈉協同睡眠實驗結果類似,在戊巴比妥鈉閾下催眠劑量睡眠實驗中同樣發現靈芝三萜酸100 mg/kg·bw的促睡眠效果強于陽性對照地西泮2.5 mg/kg。

表2 靈芝三萜酸對戊巴比妥鈉閾下劑量 睡眠發生率的影響(n=10)Table 2 Effect on sleeping rate of G. lucidum triterpene acids on the subthreshold of pentobarbital sodium in mice(n=10)

2.6 靈芝三萜酸對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

按照《保健食品檢驗與評價技術規范》[16]對靈芝三萜酸進行巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗,研究其對小鼠入睡時間的影響,結果見圖2。從實驗結果中可以看出,在巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗中,靈芝三萜酸25、50、100 mg/kg的睡眠潛伏期分別為(1712.74±177.35)、(1632.00±301.95)、(1091.58±162.44) s,與溶劑對照組(2158.09±205.49) s比較,均能極顯著縮短小鼠睡眠潛伏期(p<0.01),表明靈芝三萜酸促進小鼠入睡作用良好,且隨三萜酸劑量的增加,其促進睡眠效果呈增強趨勢;靈芝三萜酸高劑量組100 mg/kg促進睡眠作用(1091.58±162.44) s,強于地西泮2.5 mg/kg催眠作用(1212.84±107.54) s。因此,靈芝三萜酸低、中、高劑量組均能極顯著(p<0.01)縮短小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期,與巴比妥鈉協同促進睡眠效果更明顯。

圖2 靈芝三萜酸對巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗的影響(n=10)Fig.2 Effect of G. lucidum triterpene acids on barbital sodium sleep incubation period test in mice(n=10)

從戊巴比妥鈉誘導睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗及巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗結果可以看出,靈芝三萜酸與戊巴比妥鈉、巴比妥鈉均具有較好的協同作用,既能促進睡眠的發生,也有助于睡眠的維持。而靈芝三萜酸對睡眠的調節作用機制由經典神經遞質、非典型性神經遞質、細胞因子、激素或肽類中的一種或多種機制共同參與則有待于進一步深入研究。

3 結論

本實驗研究通過直接睡眠實驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗研究了自制靈芝三萜酸的改善睡眠作用。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》[16],延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠實驗中,兩個實驗結果呈現陽性,即可判定受試物具有改善睡眠的效果。本研究顯示,靈芝三萜酸延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠實驗中的結果均呈現陽性,且100 mg/kg劑量組在三個實驗中的促睡眠效果強于陽性對照地西泮(2.5 mg/kg),說明靈芝三萜酸具有很好的改善睡眠的作用。

綜上所述,本實驗研究通過對靈芝三萜酸促進睡眠的研究,確定靈芝三萜酸具有明顯的改善睡眠作用,關于靈芝三萜酸改善睡眠作用的作用機制本課題組將進一步研究。