基于響應面法優化的秘魯魷魚肌肉嫩化工藝研究

魏婉瑩，趙金麗，張小利，沈春蕾，張賓

（浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室，浙江舟山316022）

秘魯魷魚（Dosidicus gigas）又稱巨型槍烏賊、美洲大魷魚，其體形巨大，全身肉質幾乎均可食用，其也是資源最豐富的魷魚種類之一。秘魯魷魚含有豐富的蛋白質、必需氨基酸、微量元素及多不飽和脂肪酸等，兼具有預防貧血、降低膽固醇和甘油三酯含量、預防動脈粥樣硬化和防止心血管疾病等功效，因此素有“窮人的鮑魚”的美譽[1]。秘魯魷魚營養價值及產量高、價格較低廉，也非常符合現代消費對營養的需求。但秘魯魷魚的肌肉特性不同于魚蝦類等其它水產品，其肌肉中含有高達11%的不溶性肌基質蛋白，致使魷魚肌肉組織極其堅韌、干硬、不易被咬碎，受熱后會變得更加緊密、纖維性增強，從而嚴重影響了老年人及嬰幼兒等消費群體的食用性[2]。在一定程度下，較為堅韌的肌肉質構特性，制約了秘魯魷魚產品的加工開發與利用[3]。因此，需對魷魚的肌肉質構進行改良，以提高秘魯魷魚的加工利用價值及豐富其產品形式。

肌肉的嫩度是評價肉制品質量的首要指標，也是影響消費的重要因素。肉制品的嫩化處理是一種涉及生物、物理和化學的綜合反應過程，肌肉中膠原蛋白的降解、肌原纖維的斷裂，肌間和肌內聯結蛋白的降解和內源酶活性調節都能對肌肉起到較好的嫩化作用[4-5]。肉的嫩化方法有生物嫩化法（外源酶、激素法等）、化學嫩化法（鹽類、有機酸等）和機械嫩化法（電刺激等）等。其中，外源酶法嫩化，常采用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶、米曲蛋白酶等，通過適當斷裂肌肉中結締組織及肌纖維中的膠原蛋白、彈性蛋白等，從而提高肌肉組織的嫩度[6]。目前，已廣泛應用牛肉、羊肉、雞肉等養殖畜禽肉制品中[7-8]。但針對秘魯魷魚肌肉組織的嫩化處理及相關加工制品開發，目前還較少[9]。本研究以資源豐富的秘魯魷魚為原料，利用不同的蛋白酶對其肌肉組織進行嫩化，旨在改善魷魚肌肉嫩度，提高其口感，為高質量秘魯魷魚制品的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍秘魯魷魚，購于舟山市東河市場（體長15 cm～20 cm）。將冷凍魷魚體置于裝有碎冰的泡沫箱內，45 min 內運回實驗室。

菠蘿蛋白酶（＞500 U/mg）：浙江瑪雅試劑有限公司；木瓜蛋白酶（≥800 U/mg）、胰蛋白酶（≥250 U/mg）：上海瑞永生物科技有限公司。以上酶制劑純度均＞98%。

MDF-U53V 型超低溫冰箱：日本SANYO 公司；BS124S 型電子天平：德國賽多利斯公司；PHS-3C 酸度計：浙江納德科學儀器有限公司；HWS-12 電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司；TMS-Pro 物性測試儀：美國FTC 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理

冷凍秘魯魷魚解凍（0 ℃～2 ℃，3 h）→去頭皮及內臟，剖開胴體外套膜→胴體肌肉→縱切成3.0 cm～3.5 cm寬魷魚條→清水清洗→加入酶制劑溶液→水浴加熱處理→部分樣品冷卻至室溫（25 ℃）后測定指標→部分樣品投入到100 ℃沸水中加熱10 min→測定指標。

1.2.2 硬度及剪切力測定

采用TMS-Pro 物性測試儀，測定魷魚肌肉樣品的硬度及剪切力[10]。硬度測定：采用TMS 不銹鋼針頭探針（直徑1 mm），起始力0.6 N，測試速度60 mm/min。剪切力測定：采用不銹鋼三角形剪切刀片（厚1.2 mm），起始力0.6 N，測試速度60 mm/min。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 酶制劑種類對魷魚肌肉嫩化效果的影響

以魷魚條：蒸餾水體積比為1∶3 的比例，將魷魚條置于蒸餾水中，蒸餾水中預先加入酶制劑（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶或胰蛋白酶）濃度為200 U/100 mL，調節體系溶液pH 7.0，30 ℃水浴加熱30 min。嫩化處理后，部分樣品冷卻至室溫（25 ℃），測定（生）魷魚肌肉的硬度及剪切力；部分樣品繼續投入至100 ℃沸水中，加熱10 min 后取出冷卻至25 ℃，測定（熟）魷魚肌肉的硬度及剪切力。

1.2.3.2 酶制劑濃度對魷魚肌肉嫩化效果的影響

以魷魚條：蒸餾水體積比為1∶3 的比例，將魷魚條置于蒸餾水中，蒸餾水中預先加入菠蘿蛋白酶濃度為 60、120、180、240、300 U/100 mL，調節溶液 pH 7.0，30 ℃水浴加熱30 min。嫩化處理后，部分樣品冷卻至25 ℃，測定（生）魷魚肌肉的硬度及剪切力；部分樣品繼續投入至100 ℃沸水中，加熱10 min 后取出冷卻至25 ℃，測定（熟）魷魚肌肉的硬度及剪切力。

1.2.3.3 處理時間對魷魚肌肉嫩化效果的影響

以魷魚條：蒸餾水體積比為1∶3 的比例，將魷魚條置于蒸餾水中，蒸餾水中預先加入菠蘿蛋白酶濃度為200 U/100 mL，調節溶液pH 7.0，30℃水浴加熱15、25、35、45、55 min。嫩化處理后，部分樣品冷卻至 25 ℃，測定（生）魷魚肌肉的硬度及剪切力；部分樣品繼續投入至100 ℃沸水中，加熱10 min 后取出冷卻至25 ℃，測定（熟）魷魚肌肉的硬度及剪切力。

1.2.3.4 體系pH 值對魷魚肌肉嫩化效果的影響

以魷魚條：蒸餾水體積比為1∶3 的比例，將魷魚條置于蒸餾水中，蒸餾水中預先加入菠蘿蛋白酶濃度為 200 U/100 mL，調節溶液 pH 值為 5、6、7 和 8，30 ℃水浴加熱30 min。嫩化處理后，部分樣品冷卻至25 ℃，測定（生）魷魚肌肉的硬度及剪切力；部分樣品繼續投入至100 ℃沸水中，加熱10 min 后取出冷卻至25 ℃，測定（熟）魷魚肌肉的硬度及剪切力。

1.2.4 響應面法優化設計

通過以上酶制劑種類篩選試驗發現，菠蘿蛋白酶對魷魚肌肉組織嫩化效果最佳。綜合單因素試驗結果，進而采用Box-Behnken 中心組合設計，以菠蘿蛋白酶濃度（A）、處理時間（B）及酶溶液 pH 值（C）3 個影響因素，以魷魚肌肉硬度（Y1）和魷魚剪切力（Y2）為響應值，進行響應面分析優化試驗。

1.2.5 數據分析

采用 Origin 8.0、SPSS 13.0 及 Design Expert 8.0 進行處理，試驗數據均為3 次平行試驗的平均值，結果表示為平均值±標準偏差。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 酶制劑種類對魷魚肌肉硬度和剪切力的影響

肌肉制品的嫩化常用外源蛋白酶進行酶解處理，具體如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、胰蛋白酶、枯草蛋白酶等，通過對肌肉中的結締組織、肌纖維中膠原蛋白、彈性蛋白進行適當降解，在一定程度上破壞肌肉組織結構，從而提高肌肉的嫩度及感官品質[11]。本研究中，酶制劑種類對魷魚肌肉嫩化效果的單因素篩選試驗，如圖1、圖2 所示。

圖1 不同酶制劑對生魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.1 Effects of different enzymes on the hardness and shearing force of raw squid muscle

圖2 不同酶制劑對熟魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.2 Effects of different enzymes on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

結果發現，菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對魷魚肌肉組織的硬度值，3 個處理組間未產生顯著性差異（P ＞0.05）。對于生魷魚肌肉樣品，相比于菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶處理，木瓜蛋白酶對魷魚肌肉組織剪切特性的嫩化效果最佳，嫩化后肌肉組織的剪切力值為12.24 N，顯著低于菠蘿蛋白酶（14.38 N）和胰蛋白酶（13.57 N）處理效果（P ＜0.05）。魷魚肌肉經100 ℃加熱制熟后，菠蘿蛋白酶的嫩化效果顯著優于另兩種酶，其肌肉剪切力值為12.30 N，顯著低于木瓜蛋白酶（15.73 N）和胰蛋白酶（13.63 N）（P ＜ 0.05）。生魷魚肌肉表皮由堅韌的膠原纖維蛋白形成的網絡結構組成，其肌肉硬度和剪切力值相對較高些。經蛋白酶酶解后，由于蛋白質的部分降解作用，致使組織質構特性有所降低，肌肉嫩度特性得以改善。經水浴加熱后，魷魚肌肉中蛋白質發生了變性作用，而使得肌肉質構特性發生變化。在整個過程中，可能由于蛋白酶種類、處理方式及魷魚品種的不同，致使生、熟制魷魚質構特性有所不同[12]，其具體影響機制仍需進一步研究。本研究中，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對魷魚肌肉的嫩化效果相對較差些，可能是由于其在魷魚肌肉組織中較難以擴散，導致其對肌原纖維蛋白的酶解作用不能成分發揮[5]。此外，考慮到實際加工及消費過程，魷魚熟制品的嫩度（即剪切性能）對產品價值及消費者的可接受度影響最大，因而選擇菠蘿蛋白酶進行后續的嫩化試驗研究。

2.1.2 菠蘿蛋白酶濃度對魷魚肌肉硬度和剪切力的影響

菠蘿蛋白酶作為一種半胱氨酸蛋白水解酶，具有較強的蛋白質、肽、脂和酰胺水解能力，優先水解堿性氨基酸、芳香族氨基酸羧基一側的肽鏈，應用于畜禽肌肉的嫩化過程，可顯著提高肉制品的適口性[13]。不同菠蘿蛋白酶濃度對魷魚肌肉硬度和剪切力的影響，如圖3、圖4 所示。

圖3 不同菠蘿蛋白酶濃度對生魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.3 Effects of different bromelain concentrations on the hardness and shearing force of raw squid muscle

圖4 不同菠蘿蛋白酶濃度對熟魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.4 Effects of different bromelain concentrations on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

隨菠蘿蛋白酶濃度增加，生魷魚肌肉硬度和剪切力均呈現先下降后上升趨勢。當菠蘿蛋白酶添加濃度為180 U/100mL時，魷魚肌肉硬度和剪切力均達到最低，分別為1.86 N 和11.5 N。當菠蘿蛋白酶濃度較高時（240 U/100 mL～300 U/100 mL），魷魚肌肉硬度和剪切力值再次升高，其原因可能是由于添加菠蘿蛋白酶的酶解作用過度，魷魚肌肉肌纖維斷裂、組織結構破壞而致使脫水嚴重，導致肌肉硬度和剪切力再次上升[14]。經熟制后的魷魚肌肉，硬度和剪切力未呈現明顯變化趨勢；當菠蘿蛋白酶濃度為180 U/100mL時，肌肉硬度和剪切力達到最低（2.34 N 和10.08 N）。由上，選擇菠蘿蛋白酶濃度為180 U/100mL進行后面的試驗。

2.1.3 嫩化時間對魷魚肌肉硬度和剪切力的影響

不同嫩化時間對魷魚肌肉硬度和剪切力的影響，如圖5、圖6 所示。

圖5 不同嫩化時間對生魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.5 Effects of different tenderization time on the hardness and shearing force of raw squid muscle

圖6 不同嫩化時間對熟魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.6 Effects of different tenderization time on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

從圖中可看出，嫩化時間對于肌肉組織的硬度值未產生顯著性影響（P ＞0.05）。對于未經熟制的生魷魚，嫩化加熱35 min 時，肌肉組織剪切力達到最低為10.58 N，顯著低于其它加熱嫩滑處理時間。經過熟制后魷魚，肌肉組織剪切力未呈現明顯的變化趨勢，但仍可發現在嫩化處理35 min 時，肌肉組織硬度和剪切力均較低（2.1 N 和12.26 N）。由上，當嫩化時間過短時（＜35 min），魷魚肌肉硬度和剪切力值均不理想，其原因是菠蘿蛋白酶未能充分發揮其水解作用，組織嫩化效果不佳[15]。當嫩化時間過長（＞45 min），菠蘿蛋白酶的水解作用時間長，會造成肌肉酶解過度，同時肌肉的保水能力也大幅降低，反過來影響了肌肉的硬度和剪切特性[16]。因此，選擇嫩化處理時間為35 min 開展后面的試驗。

2.1.4 體系pH 值對魷魚肌肉硬度和剪切力的影響

不同體系pH 值對魷魚肌肉硬度和剪切力的影響，如圖7、圖8 所示。

圖7 不同體系pH 值對生魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.7 Effects of different system pH values on the hardness and shearing force of raw squid muscle

圖8 不同體系pH 值對熟魷魚肌肉硬度和剪切力的影響Fig.8 Effects of different system pH values on the hardness and shearing force of cooked squid muscle

結果發現，隨著體系pH 值的增大，生、熟制魷魚肌肉硬度和剪切力值，均呈現先下降后上升趨勢。當嫩化體系pH 值為7 時，生、熟制魷魚肌肉硬度和剪切力值均達到最低，尤其肌肉剪切力值均顯著低于其它處理組（P ＜0.05），原因是菠蘿蛋白酶此時處于較佳的活性狀態，有利于將魷魚肌肉中的膠原蛋白分解，進而提高肉的嫩度[17]。因此，選擇嫩化溶液體系pH 值為7 開展后續試驗。

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 影響因素選取及設計

根據單因素試驗結果，選取對熟制魷魚肌肉剪切力具有顯著影響的3 因素，即菠蘿蛋白酶濃度、嫩化時間和嫩化溶液pH 值，以魷魚肌肉硬度和剪切力值為響應值，進行三因素三水平Box-Behnken 中心組合試驗設計。試驗影響因素設計及響應面分析結果，如表1、表2 所示。

2.2.1.1 各因素對魷魚肌肉硬度的影響

依據表2 數據，進行回歸擬合分析，得到魷魚肌肉硬度與各因素變量的二次多元回歸模型：

Y1=1.18-0.22A+8.75B+0.03C+0.15AB-0.092AC+7.5BC+0.78A2+0.014B2-0.29C2

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 響應面分析結果Table 2 The results of response surface methodology

對該模型進行方差分析，結果如表3。

表3 試驗結果方差分析表（硬度）Table 3 Variance analysis table of test results（hardness）

續表3 試驗結果方差分析表（硬度）Continue table 3 Variance analysis table of test results（hardness）

從表3 可知，該模型極顯著（Pr＞F 值＜0.01），A、C、A2、C2在該模型中為顯著變量，AB 的交互作用為極顯著（Pr＞F 值＜0.01）?；貧w決定系數 R2=0.998 3，說明響應值的變化有99.83%來源于所選因素的變化。模型修正決定系數R2Adj=0.996 0，說明該模型能解釋99.60%響應值的變化。失擬項不顯著（Pr＞F＞0.05），可知方程對試驗擬合度較好。

2.2.1.2 各因素對魷魚肌肉剪切力的影響

依據表2 數據，進行回歸擬合分析，得到魷魚肌肉剪切力與各因素變量的二次多元回歸模型：

Y2=2.56+0.62A-0.47B+0.21C-0.32AB+0.55AC+0.99BC+4.37A2+1.64B2+2.78C2

對該模型進行方差分析，結果如表4。

表4 試驗結果方差分析表（剪切力）Table 4 Variance analysis table of test results（shearing force）

從表4 可知，該模型極顯著（Pr＞F 值＜0.01），A、B、C、A2、B2、C2在該模型中為顯著變量，BC 的交互作用極為顯著（Pr＞F 值＜0.01）?；貧w決定系數 R2=0.998 4，說明響應值的變化有99.84%來源于所選因素的變化。模型修正決定系數R2Adj=0.996 2，說明該模型能解釋99.62%響應值的變化。失擬項不顯著（Pr＞F＞0.05），可知方程對試驗擬合度較好。

2.2.2 響應面法作圖分析結果

2.2.2.1 響應面法對熟魷魚肌肉硬度的分析結果

兩因素交互作用對魷魚肌肉硬度影響的響應面圖，如圖9 所示。

圖9 兩因素交互作用對熟魷魚肌肉硬度影響的響應面圖Fig.9 Response surface diagram of the interaction of two factors on the hardness of cooked squid muscle

圖9（a）為菠蘿蛋白酶濃度和嫩化時間對硬度的影響，從圖中看出二者交互作用較好，顯示不論菠蘿蛋白酶濃度如何變化，嫩化時間的改變對魷魚硬度的影響很弱。圖9（b）顯示菠蘿蛋白酶濃度和pH 值二者交互作用較好，隨著菠蘿蛋白酶濃度增加，硬度變化較快。圖9（c）表明當嫩化時間固定時，隨著pH 值增加，硬度幾乎呈現線性變化。

2.2.2.2 響應面法對熟魷魚肌肉剪切力的分析結果

兩因素交互作用對魷魚剪切力影響的響應面圖，如圖10 所示。

圖10 兩因素交互作用對熟魷魚肌肉剪切力影響的響應面圖Fig.10 Response surface diagram of the interaction of two factors on the shear force of cooked squid muscle

圖10（a）為菠蘿蛋白酶濃度和嫩化時間對剪切力的影響，從圖中看出二者其中一個變量固定時，另一個均呈現拋物線形狀，先下降后上升。圖10（b）顯示隨著菠蘿蛋白酶濃度和pH 值升高，剪切力均先下降后上升。圖10（c）顯示隨著菠蘿蛋白酶濃度和pH 值升高，剪切力均先下降后上升。

2.2.3 驗證性試驗及結果

新鮮生魷魚受熱后，肌肉組織更加緊密堅韌、纖維性更強及不易被咬斷，致使消費者食用口感較差，尤其嚴重影響老年人及兒童等消費群體的食用可接受性。本試驗主要通過蛋白酶嫩化處理以改善消費者的產品食用口感（主要考慮牙齒切斷魷魚肌肉的特性），因而選擇以剪切力為主要評價指標，經響應面優化獲得最佳處理工藝。以肌肉剪切力為評價指標，得到秘魯魷魚肌肉嫩化效果最佳工藝為：菠蘿蛋白酶濃度213.25 U/100 mL，嫩化時間39.51 min，溶液pH 5.92?？紤]到實際操作便利，最終確定菠蘿蛋白酶濃度210 U/100 mL，嫩化時間40 min，溶液pH 6.0。在此條件下，進行了3 組嫩化處理平行試驗，最后測得熟魷魚硬度為0.97 N，剪切力為2.98 N，與理論值硬度1.12 N，剪切力2.80 N 基本相符。

3 結論

以秘魯魷魚肌肉為對象，利用單因素試驗、中心組合Box-Behnken 試驗設計及響應面分析，對秘魯魷魚肌肉嫩化工藝進行了優化研究，獲得最佳嫩化工藝為：菠蘿蛋白酶濃度210 U/100 mL，嫩化時間40 min，溶液pH 6.0，此時測得熟魷魚硬度為0.97 N，剪切力為2.98 N，與建立模型的理論預測值基本相符。本研究選用菠蘿蛋白酶為嫩化劑，通過響應面法優化獲得一種魷魚肌肉嫩化工藝，可顯著改善秘魯魷魚肌肉的質構特性。該工藝技術操作較為方便、經濟，可作為新型魷魚制品的加工開發奠定技術基礎。