不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚生長和蛋白質代謝相關基因表達的影響

楊英豪 李學山 麥康森 徐 瑋 張彥嬌 艾慶輝

(中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室，農業農村部水產動物營養與飼料重點實驗室，青島 266003)

隨著集約化養殖的不斷發展, 尋找優質蛋白源以替代魚粉(Fish meal, FM)、節約成本, 成為水產動物營養研究的熱點和難點[1—5]。研究發現, 不同蛋白源具有不同的特點, 大豆濃縮蛋白(Soy protein concentrate, SPC)由于蛋白質含量高(65%—70%的粗蛋白), 抗營養因子和纖維含量較低, 同時還具有利用率高、氨基酸平衡性好、價格低廉等優點, 成為極具潛力的魚粉替代源[6,7]。在線鱧(Channa striata)[8]和星斑川鰈(Platichthys stellatusPallas)[9]中研究發現, 用SPC替代部分魚粉可顯著提高魚體生長率和飼料轉化效率。水解魚肉蛋白(Fish hydrolysate, FH)是一種富含各種肽段、誘食好且促進魚類生長明顯的蛋白源[10,11]。在大黃魚(Larimichthys crocea)的養殖中發現, 用過濾后的水解蛋白替代40%的魚粉, 相比于全魚粉組, 不影響大黃魚的存活率和特定生長率[12]。晶體氨基酸(Crystal amino acids, CAA)可被魚體直接吸收和利用, 因此晶體氨基酸對水產養殖動物來說也是極具價值的魚粉替代源[13—15]。然而, 這幾種蛋白源在同一魚類中的替代效果尚不明確, 有待進一步研究。

日糧蛋白和內源性蛋白經胰蛋白酶、小腸刷狀緣蛋白酶和肽酶等消化后形成小肽和游離氨基酸, 經小腸吸收后進入血液循環, 被機體各組織器官吸收利用[16]。消化后的氨基酸和小肽主要由氨基酸轉運載體和小肽轉運載體(PEPT1)進行吸收[17]。機體吸收的小肽和氨基酸一方面可用于分解供能,另一方面可用來重新合成蛋白質, 蛋白質在機體的沉積是由蛋白質的分解和合成共同決定的[18,19], 其中雷帕霉素靶蛋白(TOR)信號通路對于蛋白質的合成起著至關重要的作用。哺乳動物中關于不同蛋白源調控蛋白質代謝的研究已較為系統[20,21], 然而魚類中關于不同蛋白源對PEPT1和TOR基因表達的調控及魚體生長的影響還有待進一步研究。

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli), 鯰形目、鲿科、黃顙魚屬, 溫水性魚類, 我國重要的淡水經濟養殖種類之一。近年來, 隨著瓦氏黃顙魚養殖規模的擴大, 對魚粉的需求量也隨之增加, 飼料成本逐漸加大, 因此亟待尋找合適的蛋白源替代魚粉以促進瓦氏黃顙魚養殖產業可持續發展[22]。本研究旨在比較不同蛋白源對黃顙魚生長、體組成和蛋白質代謝基因PEPT1和TOR表達的影響, 以探討不同蛋白源對黃顙魚生長性狀的影響機理, 為黃顙魚飼料中魚粉替代提供理論依據和指導。

1 材料與方法

1.1 飼料配方和飼料制作

表 1 實驗飼料配方和化學成分(%干重)Tab. 1 Formulation and chemical composition of the experimental diets (% dry matter)

分別以魚粉(FM)、大豆濃縮蛋白(SPC)、水解魚蛋白(FH)和晶體氨基酸混合物(CAA)為主要蛋白源, 魚油、豆油和大豆卵磷脂為主要脂肪源, 小麥粉為糖源制作4種等氮(粗蛋白含量為39.0%)等脂(粗脂肪含量為9.0%)的實驗飼料(表 1)。FH購自上海海清飼料公司, 其他飼料原料購自青島七好生物科技有限公司。

飼料制作前, 將飼料原料進行粉碎并過246目篩。在飼料制作過程中, 飼料原料根據配方按逐級放大原理混合均勻, 之后加入魚油、豆油和卵磷脂,手工將油脂顆粒搓勻, 然后加入適量水, 用全自動漁用餌料機(F-26(Ⅱ), 華南理工大學)進行制粒, 制成直徑為1.5 mm×3.0 mm飼料顆粒, 以45℃烘至水分含量小于10%, 用雙層塑料袋扎口保存, 置-20℃冰箱中備用。

1.2 養殖實驗和樣品采集

瓦氏黃顙魚購于四川眉山育苗場, 實驗前, 實驗魚在廣州市農業科學院白云基地循環水系統中暫養2周, 以FM組飼料進行飽食投喂, 使實驗魚逐漸適應人工飼料和養殖環境。在暫養結束后, 黃顙魚饑餓24h, 將初重(2.90±0.01) g的瓦氏黃顙魚隨機分成4組, 每組3個重復, 每個重復(桶/260 L)60尾魚。每天人工飽食投喂2次(7: 00和 18: 00), 在投喂結束后1h, 吸出殘餌在70℃烘箱中烘干至恒重, 并稱重, 每天記錄投餌量。養殖周期 66d, 養殖期間記錄每桶的死魚數量并稱重。實驗條件: 水溫,25—26℃; 溶氧, ＞6.0 mg/L; pH, 6.8—7.6; 總氨氮量, ＜0.1 mg/L; 亞硝酸鹽, ＜0.1 mg/L; 所有養殖桶均連續充氣, 光照為自然光照。

養殖中期(35d)和養殖末期(66d)采集樣品。取樣前, 將魚體饑餓24h, 統計每桶瓦氏黃顙魚數量和重量, 每桶隨機挑選10尾魚, 用MS-222麻醉(1∶10000; 上?？低∩锟萍加邢薰? 中國), 采集魚體前腸和肝臟組織, 立即置于液氮, 待樣本采集完畢后統一放于-80℃冰箱長期保存, 用于后續代謝基因的定量分析。實驗末期每桶另取6尾黃顙魚,于-20℃冰箱保存, 用于后續體組成分析。

1.3 化學分析

采用AOAC (1995)[23]標準方法對飼料原料、飼料和魚體成分進行分析; 采用全自動凱氏定氮儀(Kjeltec 2300, Sweden)測定粗蛋白含量(N×6.25); 采用索氏抽提法測定粗脂肪含量(Buchi 36680, Switzerland); 樣品于電爐上炭化后, 馬弗爐中(550℃)灼燒12h, 可得樣品灰分含量。

1.4 RNA 提取

將黃顙魚肝臟和前腸在液氮中磨成粉末, 然后放入含1 mL Trizol的無RNase離心管中, 分別加入氯仿、異丙醇、乙醇等試劑, 最后用滅菌水溶解沉淀, 具體操作過程參照李明珠[24]方法。RNA質量通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 濃度通過核酸定量儀(Nano Drop 2000 spectrophotometer, Thermo, USA)測定。將各組織樣品的RNA調成1 μg后, 用Primer-Script?Reverse Transcriptase (TaKaRa, Japan)試劑盒將RNA反轉成cDNA, 具體操作參照試劑盒說明書。

1.5 實時熒光定量PCR

采用SYBR?Green I嵌合熒光法, 使用SYBR?Premix ExTaqTM(Perfect Real Time, TaKaRa, Japan)試劑在Thermal cycler (Mastercycler ep realplex, Eppendorf, German)儀器上進行, 反應條件為: 95℃2min, 1循環; 95℃變性15s, 59℃退火15s, 72℃延伸30s, 共計40個循環。溶解曲線: 95℃, 15s; 59℃,15s, 95℃, 5min。以GAPDH和β-actin作為內參基因。在定量前, 驗證內參基因、PEPT1和TOR2基因引物(表 2)的擴增效率。本實驗PEPT1、TOR、GAPDH和β-actin基因的擴增效率分別為0.98、0.95、0.99和0.98, 隨后以Lg(模板相對拷貝數)為橫坐標, 以平均ΔCt(目的基因Ct值)-平均ΔCt(目的內參-內參基因Ct值后再平均)為縱坐標, 得到另外一條直線, 若其斜率絕對值小于0.1, 即說明目的基因與內參基因擴增效率一致, 用2-ΔΔCt進行基因表達分析[25]。分別對中期、末期瓦氏黃顙魚PEPT1和TOR基因進行RT-PCR分析, 以水解魚肉蛋白組為對照組, 對其他組的基因表達進行分析。

1.6 統計分析

生長指標計算如下:

成活率(SR, %)=100%×(末魚數量/初魚數量)特定生長率(SGR, %/d)=100%×[(Ln終末重-Ln初始重)/實驗天數]

結果采用SPSS17.0軟件進行數據處理, 在單因素方差分析(ANOVA)數據達到顯著(P＜0.05)時, 進行Tukey’s多重比較, 數據以平均值±標準誤(Mean±SEM)表示。

2 結果

2.1 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚不同生長階段存活率和生長的影響

各處理組瓦氏黃顙魚存活率(SR)無顯著差異(P＞0.05), 且SR均大于94%。在生長方面, 不同蛋白源顯著影響瓦氏黃顙魚生長性能(P＜0.05)。在第35和第66天時, FM組瓦氏黃顙魚SGR分別為4.86%/d和3.08%/d, SPC組瓦氏黃顙魚SGR分別為3.94%/d和2.55%/d, SPC組瓦氏黃顙魚SGR雖然低于FM組,但顯著高于FH組(1.13%/d和0.96%/d)和CAA組(1.69%/d和1.28%/d) (表 3)。

表 2 瓦氏黃顙魚PEPT1和TOR2基因定量所需引物序列Tab. 2 Real-time quantitative PCR primers for PEPT1 and TOR2 genes

表 3 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚不同生長階段存活率和生長的影響(平均值±標準誤, n=3)Tab. 3 Growth performance and survival of darkbarbel catfish (Pelteobagrus vachelli) fed diets at different growth stages (Mean±SEM, n=3)

2.2 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚體組成的影響

不同蛋白源顯著影響了瓦氏黃顙魚體組成。SPC替代FM會降低魚體粗蛋白含量, SPC組魚體蛋白含量僅次于FM組, 其粗蛋白含量為13.28%。SPC組瓦氏黃顙魚的粗脂肪含量顯著高于FM組(P＜0.05), 粗脂肪含量為 14.86%, SPC組瓦氏黃顙魚灰分和水分含量顯著低于其他組(P＜0.05), 分別為6.80%和69.48% (表 4)。

表 4 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚體組成的影響(平均值±標準誤, n=3, 濕重%)Tab. 4 Body composition analysis of darkbarbel catfish (Pelteobagrus vachelli) fed diets at different growth stages (Mean±SEM, n=3, wet weight %)

2.3 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚前腸PEPT1和肝臟TOR基因表達的影響

在第35和第66天時, 不同蛋白源顯著影響了瓦氏黃顙魚幼魚前腸PEPT1的表達(P＜0.05, 圖 1)。在第35天時, FM組魚體前腸PEPT1基因表達量顯著高于其他處理組(P＜0.05), SPC組魚體前腸PEPT1表達量顯著高于FH和CAA組(P＜0.05)。在第66天時,SPC組魚體前腸PEPT1表達量顯著高于FM組(P＜0.05)。在第35和第66天時, 不同蛋白源并未顯著影響瓦氏黃顙魚肝臟TOR基因的表達水平(P＞0.05,圖 2)。

3 討論

3.1 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚不同生長階段存活率和生長的影響

本實驗發現4種蛋白源對瓦氏黃顙魚存活率無顯著影響, 說明瓦氏黃顙魚對養殖條件和實驗飼料較為適應。在第35和第66天時, FM組實驗魚的生長性能達到最大, 顯著高于其他各實驗組; 通過比較瓦氏黃顙魚SGR發現, SPC組雖然低于FM組, 但顯著高于FH組和CAA組, 說明SPC是較理想的魚粉替代源。SPC組的瓦氏黃顙魚具有相對較好的生長性狀, 這可能和SPC的特性相關, SPC蛋白含量高達65%—70%, 抗營養因子含量低, 同時SPC具有利用率高等特點[26], 因此, 使用SPC飼喂魚體能使魚體獲得較好的生長性能。在大黃魚[27]、真鯛(Pagrus major)[28]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[29]中使用SPC進行投喂, 魚體均具有較高的SGR。但是SPC缺乏魚體生長所需的蛋氨酸, 因此本實驗SPC的替代效果稍差于魚粉, 這可能與SPC中缺乏蛋氨酸有關[30,31]。

3.2 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚體組成的影響

蛋白源會影響魚體組成, 在本實驗中魚粉組瓦氏黃顙魚的粗蛋白含量顯著高于其他組。這可能與魚粉具有較高的氨基酸平衡性有關[32—34], 魚粉水解出的氨基酸更有利于魚體蛋白沉積, 而這一點在其他實驗中也得到類似的結果。周暉等[35]用酵母粉、脫脂豆粕和玉米蛋白粉分別替代10%的魚粉,飼喂體重30—38 g的軍曹魚(Rachycentron canadum)幼魚5周, 結果發現FM組軍曹魚體蛋白含量最高。李學麗等[36]用2種豆粕部分替代魚粉, 發現魚粉組珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus×Epinephelus lanceolatus)幼魚的全魚體蛋白含量顯著高于其他組。本實驗同樣發現, SPC組瓦氏黃顙魚的體脂含量達到最大。與其他魚粉替代源相比, SPC含有較少的抗營養因子, 雖然其氨基酸平衡性稍差于魚粉, 但仍優于其他植物蛋白源, 有利于蛋白或糖類等轉化為脂肪儲存。SPC的這種特性在其他研究中也得到驗證, Kissinger等[37]以SPC和其他蛋白源替代魚粉飼喂長鰭(Seriola rivoliana) 9周, 發現其他組魚體粗脂肪含量顯著低于80%SPC組。

圖 1 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚前腸PEPT1 mRNA表達的影響Fig. 1 Effects of different dietary protein sources on PEPT1 mRNA expressions in the foregut of darkbarbel catfish圖中數值為平均值±標準誤(n=3), 含有相同字母或沒有上標代表差異不顯著(P≥0.05); 下同Data are presented as means±SEM (n=3). Means in each bar sharing the same superscript letter or absence of superscripts are not significantly different determined by Tukey's test (P≥0.05),the same applies below

圖 2 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚肝臟TOR mRNA表達的影響Fig. 2 Effects of different dietary protein sources on TOR mRNA expressions in the liver of darkbarbel catfish

3.3 不同蛋白源對瓦氏黃顙魚幼魚前腸PEPT1和肝臟TOR基因表達的影響

不同蛋白源會顯著影響魚體蛋白質代謝相關基因的表達, 對虹鱒[38]飼喂含小肽、游離氨基酸和完整蛋白質的飼料會顯著影響虹鱒腸道PEPT1的表達。在本實驗中, 第35天和第66天時, FM組和SPC組黃顙魚前腸PEPT1的表達高于其他組。相比于CAA、SPC和FM可被魚體腸道蛋白酶水解為小肽, 可提高PEPT1 mRNA的表達, 促進魚體對蛋白的吸收, 從而增加魚體的蛋白沉積, 有利于魚體生長, 這表明SPC是較好的FM替代源。在33d和66d時, FH組魚體PEPT1 mRNA表達量最低, 在大菱鲆(Scophthalmus maximusL.)[39]上也發現類似結果。然而, 在大西洋鮭(Salmo salarL.)[40]、鯉(Cyprinus carpioL.)[41]和黃金鱸(Perca flavescens)[42]的相關研究中卻得到不同的結果, 這很可能是由于魚種、水解底物等不同所引起的。

PEPT1的表達還和生長階段、能量水平等因素有關。在早期發育階段, 鱖(Siniperca chuatsi)[43]腸道PEPT1表達量較高, 而隨著魚體體重的進一步增加, 腸道PEPT1的表達量逐漸下降并趨于穩定。在能量影響PEPT1的研究中, 高能量(13.17 kJ/kg)組肉雞空腸和回腸PEPT1表達量顯著低于低能量組(12.34 kJ/kg)[44]。在本實驗中, 在33d時FM組魚體PEPT1表達量較高, 而66d時FM組魚體PEPT1表達量出現一定程度下降。這可能是FM相比于CAA和FH, FM能量更高,PEPT1表達上升有利于黃顙魚吸收能量物質, 用于生長, 而隨著黃顙魚體重進一步增加,PEPT1表達出現一定程度地下降。

綜上所述, SPC的替代效果盡管差于FM, 但顯著優于FH和CAA, 這可能是由于SPC上調前腸PEPT1的表達、促進魚體對小肽的吸收所致, 表明SPC可作為一種魚粉替代的優質蛋白源。