饑餓及復投喂對金錢魚腸型脂肪酸結合蛋白基因表達的影響

劉建業 陳華譜 江東能 吳天利 田昌緒 李廣麗 朱春華 鄧思平

(1. 廣東海洋大學水產學院, 湛江 524088; 2. 廣東省名特優魚類生殖調控與繁育工程技術研究中心, 湛江 524088;3. 海洋生態與養殖環境湛江市重點實驗室, 湛江 524088)

脂肪酸結合蛋白(Fatty acid-binding proteins,Fabp)屬于脂質結合蛋白超家族成員, 這一類蛋白質的分子量較低, 廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物的多種組織細胞的胞漿中, 是一種胞質蛋白質,對細胞內長鏈脂肪酸的攝取、轉運及代謝調節發揮著重要作用, 主要參與脂肪酸的運輸, 可將脂肪酸從細胞膜運送到甘油三酯和磷脂合成的位點[1]。

目前發現的Fabp蛋白有18種類型, 都是以分離或鑒定的第一種組織命名, 有腸型、心型、脂肪型、肝臟型、腦型、回腸型、上皮細胞型和髓磷脂型等[1—3]。腸型脂肪酸結合蛋白(Intestines fatty acid binding protein, Ifabp)是首先從腸黏膜細胞液中分離出來的脂肪酸結合蛋白, 擁有一個單配體結合位點[4], 因此能夠特異結合未酯化的游離長鏈脂肪酸并參與其運輸[5]。目前在大黃魚(Larimichthys crocea)[6]、建鯉(Cyprinus carpiovar. jian)[7]、斑馬魚(Danio rerio)[8]、大西洋鮭(Salmo salar)[9]等少數魚類克隆得到ifabp基因序列, 饑餓及復投喂對大黃魚ifabp基因表達具有顯著影響, 但在金錢魚中, 腸型脂肪酸結合蛋白基因(ifabp)的分離和在脂肪代謝中的作用尚未見報道。

金錢魚(Scatophagus argus)隸屬鱸形目(Perciformes), 金錢魚科(Scatophagidae), 金錢魚屬(Scatophagus)廣鹽性魚類, 且雜食性, 廣泛分布于溫帶和亞熱帶及熱帶地區, 具有極強的環境適應性和抗逆性, 是一種具有觀賞和食用價值的名貴海水經濟魚類。目前, 金錢魚的研究主要集中于生物學[10]、繁殖生物學[11]、溫度和魚油對其卵巢發育的影響[12,13]和雌激素受體在卵黃生成中的功能[14]。有關金錢魚生長調控的研究僅見生長激素在雌雄間的二態性表達[15], 不同性別養殖金錢魚生長性能及消化酶活性的比較[16]、饑餓復投喂對spexin[17]和igfbp基因表達的影響[18]。為闡明Ifabp在金錢魚脂肪代謝中的作用, 本文克隆并分析了金錢魚2種脂肪酸結合蛋白基因(ssifabp2a和ssifabp2b), 半定量反轉錄-聚合酶鏈反應(Semi-quantitative reverse transcription PCR, RT-PCR)檢測了這2種基因在組織中的分布情況, 實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)檢測了饑餓-復投喂處理后, 這2種基因在腸和肝臟中的表達變化, 研究結果可為探討ifabp基因在脂肪代謝中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆和組織表達實驗所采用的金錢魚(體長: 15—19 cm; 體重: 100—180 g)購自廣東省湛江市霞山區水產品批發市場, 取雌和雄各3尾用于組織表達。饑餓和復投喂所采用的實驗魚為海捕金錢魚魚苗, 并在廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地喂養至1齡左右的金錢魚(體重: 52—60 g)。所有金錢魚均采用MS-222麻醉后于冰上取所需組織后立即投入液氮保存, 隨后轉于-80℃低溫冰箱保存用于總RNA的提取和反轉錄成cDNA。

1.2 方法

總RNA提取及反轉錄采用TRIzol(Invitrogen)試劑提取總RNA, 實驗操作根據試劑盒說明書的要求進行, cDNA利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄酶(TaKaRa)合成。

基因克隆和序列分析利用本實驗室建立的金錢魚肝臟轉錄組數據庫, 篩選出與大黃魚ifabpb基因相似度較高的unigene片段, 利用軟件primer premier 6.0設計引物對(ifabp2a-f: ctgcagag tcgtccagttcac、ifabp2a-r: cttttggctttattaaaaccc)和(ifabp2b-f: ttcttcatcgccagcccagcca、ifabp2b-r: tcttt ccaaggtgcataagact)分別用于包含ssifabp2a和ssifabp2b開放閱讀框的序列擴增。PCR反應的條件為: 94℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 60s, 33個循環。擴增產物經12 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳, 切下目的片段, 用瓊脂糖回收試劑盒回收、純化目的片段。將回收產物按3∶1的比例與pMD19-T (TaKaRa)載體連接。連接產物5 μL用于轉化Escherichia coliDH5α,通過菌落PCR獲得的陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用DNAstar軟件比較金錢魚與其他脊椎動物Ifabp氨基酸序列同源性。利用MEGA6.0鄰位相聯法 (Neighbor-joining),重復1000次, gap處理為缺失, 基于Ifabp氨基酸序列構建各物種系統進化樹。

組織表達以下丘腦、垂體、鰓、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、胃、腸、性腺和肌肉11個組織反轉錄出的cDNA為模板, 以獲得的ssifabp2a和ssifabp2b序列設計特異引物對(qifabp2a-f1: cgaaact gatcagcagaacttg、qifabp2a-r1: aaaaccctgtgaaattcaaaa ctt)和(qifabp2b-f1: catttgtggttttctcgtaagtg、qifabp2br1: gacatggtgctccctcagtt)RT-PCR分別用于檢測ssifabp2a和ssifabp2b在組織中的表達。兩對特異引物擴增的長度分別為173和198 bp。β-actin基因做為內參, 內參基因β-actin引物對(β-actinF: gagaggtt ccgttgcccagag,β-actinR: cagacagcacagtgttggcgt)的擴增長度為145 bp。

饑餓及復投喂對腸、肝臟中ssifabp2a與ssifabp2b基因表達的影響用于饑餓和復投喂的金錢魚隨機分為2d對照組、2d饑餓組、7d對照組、7d饑餓組和復投喂組, 每組2個網箱, 每個網箱喂養4尾魚。對照組為正常投喂2d和7d的實驗魚;饑餓組為饑餓2d和7d的實驗魚; 復投組為饑餓7d后再次投喂, 并在投喂3h后取樣的實驗魚。實驗魚經2周馴化后用于饑餓和復投喂處理, 每天定量(餌料按體重的2%投喂)、定時(上午9:00)投喂(餌料購于中國悅群海洋生物研究開發公司)。每次取樣為定時取樣(上午10:00), 均取2個網箱的全部8尾魚的肝臟和腸用于總RNA的提取和反轉錄成cDNA, 并用于基因表達檢測。以β-actin基因作為內參, 以與組織表達相同的引物對為引物, 采用ABI 7500熒光定量PCR儀, SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO, Japan)試劑盒, 利用qPCR檢測饑餓及復投喂后金錢魚的腸和肝臟中ifabp2a和ifabp2b基因表達變化。qPCR反應程序為: 95℃預變性1min;95℃變性15s, 58℃退火15s, 72℃延伸45s并收集熒光信號, 共40個循環; 然后進行融解曲線分析?；跇藴是€方法,β-actin、ssifabp2a與ssifabp2b基因的擴增效率分別為1.06、0.95和0.97。

數據分析每個實驗樣品重復2次, 根據qPCR所得的Ct值取平均值, 運用2-ΔΔCt計算ssifabp2a和ssifabp2b基因相對表達量。所有數據均以平均值±標準誤(x±SE)表示。利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA), 采用Duncan’s多重比較法進行各組之間ifabp2a和ifabp2b基因的表達差異, 當P＜0.05時, 各組間具有顯著性差異。

2 結果

2.1 ssifabp2a與ssifabp2b基因序列分析

從金錢魚肝臟轉錄組數據庫篩選出與大黃魚ifabpb基因相似度較高的unigene片段, 經過亞克隆測序驗證后, 得到金錢魚ssifabp2a(GenBank登錄號: MH118291)與ssifabp2b基因(GenBank登錄號:MH396540)的cDNA序列。ssifabp2a與ssifabp2b兩者開放閱讀框長度都為399 bp, 且都編碼133個氨基酸。同源性比較發現, Ifabp2a和Ifabp2b與其他硬骨魚類腸型脂肪酸結合蛋白同源性較高; ssIfabp2a與其他硬骨魚類Ifabp2a、Ifabp或IfabpX1的同源性為(78.8%—87.9%), 與月光魚(Xiphophorus maculatus)IfabpX1、歐洲鱸(Dicentrarchus labrax) Ifabp、塞內加爾鰨(Solea senegalensis) Ifabp2a和尖吻鱸(Lates calcarifer) Ifabp的同源性分別為78.8%、87.9%、79.5%和85.6%; ssIfabp2b與其他硬骨魚類Ifabp2b或Ifabp-like的同源性為(79.5%—87.9%), 與月光魚Ifabp-like、歐洲鱸Ifabp2、塞內加爾鰨Ifabp2b和尖吻鱸Ifabp2b或Ifabp-like分別為79.5%、84.7%、87.9%和87.1%; ssIfabp2a與ssIfabp2b的同源性為73.5%。聚類結果表明, ssIfabp2a與其他硬骨魚類Ifabp2a、Ifabp或IfabpX1聚為一類, ssIfabp2b則與其他魚類的Ifabp2b或Ifabp-like聚為一類(圖 1)。

2.2 ssifabp2a與ssifabp2b在組織中的表達

RT-PCR檢測ssifabp2a與ssifabp2b在各個組織中的表達情況發現: 在雄魚中,ssifabp2a在腸中表達最強, 在腎、肝臟、精巢、胃、下丘腦、心和鰓中有微弱表達, 在腦垂體、脾、肌肉沒有檢測到表達;ssifabp2b也在腸組織中表達最強, 在下丘腦、鰓、心、肝臟、胃、精巢和肌肉中有微弱表達, 在腦垂體、脾和腎中沒有檢測到表達。在雌魚中,ssifabp2a在胃中表達最強, 在腎、肝臟和下丘腦組織表達較弱, 在其他組織中有微弱表達, 腦垂體中沒有檢測到表達; 與ssifabp2a表達情況不同,ssifabp2b在下丘腦、卵巢、心臟和腸中表達較強, 其他組織中有微弱表達, 鰓中沒有檢測到表達(圖 2)。

2.3 饑餓及復投喂對腸、肝臟中ssifabp2a與ssifabp2b基因表達的影響

圖 1 基于NJ法構建的金錢魚和其他硬骨魚類的Ifabp系統進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of S. argus and other teleost Ifabp based on Neighbor-Joining method using MEGA6.0本進化樹采用MEGA6.0軟件(鄰位相連法)構建, 系統樹中結點處數值代表1000次評估的自舉檢驗置信度。各物種的Ifabp蛋白在GenBank登錄號分別為: 花鳉(Poecilia reticulata) Ifabplike: XP_008433909.1; 秀美花鳉(Poecilia formosa) Ifabp-like:XP_007562596.1; 月光魚(Xiphophorus maculatus) Ifabp-like:XP_005813454.1; 蝦虎魚(Nothobranchius furzeri) Ifabp-like:XP_015802465.1; 青鳉(Oryzias melastigma) Ifabp-like:XP_024144067.1; 花鱸(Lateolabrax japonicus) Ifabp2b:APG58402.1; 塞內加爾鰨(Solea senegalensis) Ifabp2b: ALC 78633.1; 歐洲鱸(Dicentrarchus labrax) Ifabp2: ATJ34039.1; 尖吻鱸(Lates calcarifer) Ifabp2b: AGL33438.1; 尖吻鱸Ifabp-like:XP_018543508.1; 歐洲鱸Ifabp: AHK05999.1; 花鱸(Lateolabrax japonicus) Ifabp: AOW69620.1; 尖吻鱸Ifabp: XP_018551190.1;塞內加爾鰨Ifabp2a: ALC78632.1; 海洋青鳉(Oryzias melastigma) Ifabp: XP_024145490.1; 蝦虎魚(Nothobranchius furzeri) Ifabp: XP_015799257.1; 月光魚IfabpX1: XP_005807197.1; 花鳉(Poecilia reticulata) Ifabp: XP_008409747.1;秀美花鳉(Poecilia formosa) Ifabp: XP_007551827.1Distances are used to construct the phylogenetic tree and bootstrap values are based on 1000 resampling replicates. The branch length scale in terms of genetic distance is indicated above the tree

QPCR結果發現, 饑餓及復投喂可顯著影響ssi-fabp2a與ssifabp2b基因的表達。在饑餓2d后, 腸中ssifabp2a表達量顯著降低,ssifabp2b無顯著性變化;在饑餓7d后,ssifabp2a的表達量顯著下降, 但ssifabp2b與對照組無顯著差異; 與7d饑餓組相比較,在復投喂后,ssifabp2a恢復到正常水平,ssifabp2b的表達量顯著上升(圖 3、圖 4)。在饑餓2d后, 肝臟中ssifabp2a表達量無顯著變化, 而ssifabp2b的表達量顯著升高; 在饑餓7d后, 肝臟中ssifabp2a和ssifabp2b的表達量均顯著升高; 在復投喂后,ssifabp2a和ssifabp2b表達量恢復到正常水平(圖 5、圖 6)。

圖 2 RT-PCR檢測雄性(♂)和雌性(♀)金錢魚組織中ssifabp2a與ssifabp2b的表達情況Fig. 2 Expression of ssifabp2a and ssifabp2b at tissues in male (♂) and female (♀) S. argus by RT-PCR M. DL2000 Marker; Hy. 下丘腦; P. 腦垂體; Gi. 鰓, L. 肝臟, He. 心臟, Sp. 脾臟, K. 腎臟, St. 胃, I. 腸, Go. 性腺, Mu. 肌肉, -. 空白; βactin為內參基因

圖 3 饑餓和復投喂對金錢魚腸中ifabp2a基因表達的影響Fig. 3 Effects of fast feeding and refeeding on the expression of ifabp2a in the intestine of S. argus字母不同表示同一時間各實驗組之間存在顯著性差異(P＜0.05);下同Values with the same letters are not significantly different at the same time (P＜0.05); the same applies below

圖 4 饑餓和復投喂對金錢魚腸中ifabp2b基因表達的影響Fig. 4 Effects of fast feeding and refeeding on the expression of ifabp2b in the intestine of S. argus

圖 5 饑餓和復投喂對金錢魚肝臟中ifabp2a基因表達的影響Fig. 5 Effects of fast feeding and refeeding on the expression of ifabp2a in the liver of S. argus

圖 6 饑餓和復投喂對金錢魚肝臟中ifabp2b基因表達的影響Fig. 6 Effects of fast feeding and refeeding on the expression of ifabp2b in the liver of S. argus

3 討論

從NCBI數據庫和現有文獻中發現, 很多魚類擁有2種類型的ifabp基因,ifabp基因命名方式主要有3種: 第一種是ifabp2a和ifabp2b, 如塞內加爾鰨等;第二種是ifabp和ifabp-like, 如花鳉等; 第三種是ifabp-like和ifabpX1, 如月光魚等。本研究從金錢魚腸組織中克隆得到了金錢魚ssifabp2a和ssifabp2b基因的cDNA序列。對ssifabp2a和ssifabp2b基因進行序列分析和同源比對發現, Ifabp2a和Ifabp2b與其他硬骨魚類腸型脂肪酸結合蛋白同源性較高。在構建的進化樹中發現, ssifabp2a和其他硬骨魚類的Ifabp2a、Ifabp和IfabpX1聚為一簇, ssifabp2b和其他硬骨魚類的Ifabp2b和Ifabp-like聚為一簇。因而,ifabp2a、ifabp和ifabpX1可能屬于命名規則不同的同一亞型的ifabp基因, 而ifabp2b和ifabp-like屬于另一類ifabp亞型基因。根據序列分析結果, 本研究將克隆得到的2種金錢魚腸型脂肪酸結合蛋白命名為ssifabp2a與ssifabp2b。

有研究表明,ifabp基因在魚類的腸、腦、胃、肝臟和肌肉等組織中均有表達, 在腸中的表達量普遍最高[19,20]。與斑馬魚[8]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[21]和建鯉[7]腸中表達量最高類似, 在金錢魚雄魚腸中的ssifabp2a和ssifabp2b表達量也最高。腸中ifabp的高表達表明, Ifabp在金錢魚腸道脂肪酸的代謝過程中同樣起重要作用。但在金錢魚雌魚腸中,ssifabp2b表達較強, 而ssifabp2a表達較弱, 造成這種現象的原因可能與金錢魚雌魚生長顯著快于雄魚有關[22]。此外, 與在斑馬魚肝臟、腦、精巢和肌肉中也檢測到ifabp微弱表達基本一致, 雄性金錢魚ssifabp2a在腎、肝臟、精巢、胃、下丘腦、心和鰓中有微弱表達,ssifabp2b在下丘腦、鰓、心、肝臟、胃、精巢和肌肉中微弱表達, 其他組織無表達。在雌魚中,ssifabp2a在胃、腎、肝臟和下丘腦有較強表達, 在其他組織中有微弱表達, 腦垂體中沒有檢測到表達; 與ssifabp2a表達情況不同,ssifabp2b在下丘腦, 卵巢和心臟中有較強表達, 其他組織中有微弱表達, 鰓中沒有檢測到表達。造成這種組織差異表達的原因尚未明確。哺乳動物和鳥類不同類型的脂肪酸結合蛋白一般在單一組織中表達, 如人、鼠、雞等Ifabp基因僅在腸中表達[23—25]。在金錢魚中, 在多個組織中都可檢測到ifabp基因的表達, 在其他魚類中也同樣發現ifabp基因在多個組織中表達, 如斑馬魚、大黃魚、虹鱒和建鯉等, 根據表達模式的不同, 相比于哺乳動物和鳥類單一組織表達模式, 推測ifabp基因在魚類中功能可能更為廣泛。

在金錢魚中發現, 金錢魚饑餓處理2d和7d后,腸中ssifabp2a都顯著下降, 在復投喂后,ssifabp2a的表達量顯著升高, 但仍顯著低于對照組; 在饑餓2d、7d過程中,ssifabp2b均無顯著性變化, 復投喂后顯著上升。在肝臟中, 饑餓2d時,ssifabp2a無顯著變化,ssifabp2b顯著升高, 在饑餓7d時,ssifabp2a和ssifabp2b均顯著升高, 復投喂后均顯著降低到對照組水平。在大黃魚中, 饑餓對大黃魚腸和肝中ifabpb基因表達呈現出先上升后下降的趨勢, 與金錢魚不同, 在復投喂后, 腸和肝臟中ifabpb表達量均顯著升高。腸型脂肪酸結合蛋白(Ifabp)在動物體內的主要作用是調節脂肪酸的攝取和胞內轉運。有大量的研究表明,ifabp基因的表達受到各種因素的影響, 如哺乳動物小鼠受年齡、飼料中脂肪含量、激素等[26,27], 非洲爪蟾蜍(Xenopus laevis)ifabp受甲狀腺激素[28], 大西洋鮭(Salmo salar)受飼料脂肪含量[9], 大黃魚受饑餓[6]等影響。本研究發現, 在金錢魚ssifabp2a和ssifabp2b的表達同樣受到饑餓的影響。已有研究表明, 調節脂代謝使體內能源平衡是一個復雜的過程, 此過程需要很多調控系統協調完成。在大西洋鮭的脂肪代謝相關研究發現, 脂肪酸作為信號分子結合到轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體上并使其激活, 然后通過這個轉錄因子和Fabps啟動子元件相互作用來誘導Fabps基因的轉錄和翻譯[9,29]。尼羅羅非魚的研究發現, 長期饑餓會導致組織中脂肪降解產生的脂肪酸被大量代謝, 用來產生能量, 當脂肪酸下降到一定濃度時會導致基因ifabp表達量顯著降低[1,30]。在肝臟中, 饑餓2d時,ssifabp2a無顯著變化,ssifabp2b顯著升高, 在饑餓7d時,ssifabp2a和ssifabp2b均顯著升高, 復投喂后均顯著降低到對照組水平。相比于腸組織, 肝臟中的ssifabp2a和ssifabp2b表達量在饑餓2d和饑餓7d相比于對照組都是顯著上升的。推測造成這種現象的原因可能與金錢魚長期饑餓缺乏脂肪來源, 會導致大量氧化分解體內組織中脂肪酸等物質[30], 從而促進ifabp的表達, 所以肝臟中的ssifabp2a和ssifabp2b表達量在饑餓2d到饑餓7d都顯著上升。這與瓦氏黃顙魚饑餓30d肝中Ifabp基因表達量持續上升[20]和大黃魚饑餓初期肝中的Ifabpb基因表達有顯著性增加[6]的結果一致。在饑餓及復投喂處理中, 腸和肝中ssifabp2a和ssifabp2b的表達量都有顯著變化, 表明兩者都參與了金錢魚的脂肪代謝過程, 兩者的作用機制有待進一步研究。