三種不同的銅源對珍珠龍膽石斑魚生長、抗氧化酶活性及腸道形態的影響

郭鑫偉 麥浩彬 遲淑艷, 譚北平, , 姚亞軍 姚紅梅 董曉慧, , 楊奇慧, 劉泓宇, 章 雙,

(1. 廣東海洋大學水產動物營養與飼料實驗室, 湛江 524088; 2. 廣東省水產動物精準營養與高效飼料工程技術研究中心, 湛江524088; 3. 農業部華南水產與畜禽飼料重點實驗室, 湛江 524088; 4. 長沙興嘉生物工程有限公司, 長沙 410128)

銅(Cu)作為動物的必需微量元素在中各組織的生理生化學過程中承擔著重要的生物學功能[1],例如銅作為超氧化物歧化酶的輔助因子, 參與清除自由基和電子傳遞一系列生物過程[2,3]; 作為細胞色素氧化酶、酪氨酸酶和抗壞血酸氧化酶的成分,影響體表色素形成和骨骼發育; 同時, 銅還參與鐵的吸收及代謝, 影響機體健康[4]。

礦物元素可以與有機化合物如碳水化合物、氨基酸和水解蛋白質(肽)等螯合, 使其可以在吸收位點以離子的形式釋放出去, 同時也能作為一種完整的螯合物被吸收, 能夠最大限度地減少與其他礦物元素的競爭以及原料中植酸、粗纖維等物質的螯合, 從而增強礦物元素的吸收。因而, 不同的銅源在魚體內的吸收、運輸和代謝效率是存在差異的[5]。銅在飼料中最常見的添加形式是硫酸銅(CuSO4)[6-8]。與CuSO4相比, 魚類攝食堿式氯化銅和氨基酸螯合銅可以獲得更好的生長[9-12]。并且,有機銅螯合物在水中的溶解度比CuSO4的溶解度低[11], 可以減少養殖水體污染。

珍珠龍膽石斑魚(Epinephelus lanceolatus♂×Epinephelus fuscoguttatus♀)具有生長快速、抗病力強、經濟價值高等優勢[13]。本研究通過在飼料中添加硫酸銅(CuSO4)、甘氨酸銅(Cu-Gly)和羥基蛋氨酸銅(Cu-HMA)三種銅源投喂珍珠龍膽石斑魚,評估飼料中銅源對珍珠龍膽石斑魚生長性能、抗氧化酶以及腸道形態結構的影響, 以期為石斑魚飼料中銅的添加形式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料配制

參考斜帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)[14,15]、點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)[11,16]銅需要量, 在飼料中分別添加CuSO4、Cu-Gly和Cu-HMA,在基礎飼料中銅的實際含量分別為5.45、5.94和5.53 mg/kg, 配制3組等氮等脂的實驗飼料(表 1)。所有原料經粉碎后過60目篩, 與預混合的微量組分經過V型立式混合機(浙江正泰電器股份有限公司,JS-14S型)進行一次混合, 再與預混合的魚油和磷脂油于小型攪拌機(恒聯食品機械廠, B20-H型)中二次混合后經雙螺桿擠條機(華南理工大學, F-75型)制成粒徑為3 mm的顆粒飼料。在室溫條件下自然風干至水分含量為10%左右, 分裝封口, -20℃冰箱保存備用。

1.2 試驗用魚及飼料管理

試驗用珍珠龍膽幼魚(購于湛江東海島石斑魚苗場), 暫養于東海島廣東海洋大學海洋生物研究基地室外水泥池, 投喂商品飼料馴化10d。試驗共設3個處理組, 每個處理3個重復, 每個重復放養珍珠龍膽石斑魚30尾, 養殖8周。每天飽食投喂2次(8:00和17:00)。

試驗用水為經過沉淀、沙濾的天然海水, 試驗期間每天換水1次, 換水量約為養殖水體的2/3, 養殖期間水溫(29.08±0.85)℃, 海水鹽度27—29, 水體溶解氧量≥5 mg/L, 氨氮含量≤0.03 mg/L, 水體銅的含量為1.32 μg/L。觀察石斑魚攝食情況, 記錄死亡數。

1.3 樣品采集與處理

養殖試驗結束, 禁飼24h后稱重, 記錄存活尾數,計算成活率、增重率和特定生長率。每個重復隨機取3尾魚測體長、體質量后備測全魚常規養分以及全魚礦物質含量; 另取5—7尾魚尾靜脈采血, 放入1.5 mL離心管中, 4℃靜置12h, 4000×g, 4℃離心10min, 分離上清液, 保存于-80℃超低溫冰箱, 用于測定血清生化指標和血清酶活力; 解剖取肝臟稱重后迅速于液氮中, 后置于-80℃保存, 用于測定肝臟酶活力; 剝離脊椎骨-20℃保存, 用于測定脊椎骨礦物質含量; 剝離取腸道置于10%甲醛溶液中固定,用于制作腸道組織學切片。

1.4 測定方法

常規養分試驗飼料和全魚營養成分均參照AOAC[17]的方法進行測定: 水分含量采用105℃烘干恒重法測定, 粗蛋白質含量采用凱氏定氮法(Kjeltec 8400 凱氏定氮儀)測定, 粗脂肪含量采用索式抽提法測定, 粗灰分含量采用550℃馬弗爐灼燒法測定。

生理生化、抗氧化酶血清總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量運用全自動生化分析儀(Hitachi-7020型)進行測定。

血清銅藍蛋白(Ceruloplasmin, CP)活性、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行檢測。

礦物元素含量準確稱量實驗飼料、全魚、脊椎骨0.1—0.15 g置于消解罐中, 加入8 mL硝酸(Merck, 德國)和2 mL雙氧水, 放入微波消解儀(CEM MARS)消解。在趕酸后轉入比色管中, 用超純水定容。采用等離子體質譜儀(Thermo ICAP-6000 series)測定Cu、Fe、Mn、Zn四種元素含量。同時測定試驗養殖水體中礦物質含量。

腸道石蠟切片蘇木精-伊紅(HE)染色的石蠟切片(武漢谷歌生物科技有限公司制作)在4倍全自動生物顯微鏡(DM600)下觀察、拍照, 用體視顯微鏡(SZX7)測量皺襞高度(Plica height, PH), 皺襞寬度(Plica width, PW)和肌層厚度(Muscle thickness,MT), 每張切片分別隨機選擇10個位置測定相應數據。

1.5 計算方法

成活率(Survival rate,SR, %)=100%×Nt/N0;

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=100%×(Wt-W0)/W0;

特定生長率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100%×(lnWt-lnW0)/t;

飼料系數(Feed coversion ratio,FCR)=F/(Wt-W0);

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×;肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=100×Wh/Wt;臟體比(Viscerosomatic index,VSI)= 100×Wv/Wt。

式中:Nt為終末存活尾數,N0為初始放養尾數,Wt為終末體重(g),W0為初始體重(g),t為試驗天數(d),F為飼料攝入量干重(g),Lt為終末體長(cm),Wh為肝臟重量(g),Wv為內臟團重量(g)。

1.6 數據處理與統計分析

所有數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示,所有取得的試驗數據均在SPSS 20.0軟件進行單因素分析, 當不同處理之間有顯著差異(P＜0.05)時, 用Duncan氏法多重比較檢驗。

2 結果

2.1 珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能

飼料中的銅源對珍珠龍膽的SR和FCR均無顯著影響(P＞0.05, 表 2)。Cu-Gly組和Cu-HMA組WGR、SGR顯著高于CuSO4組(P＜0.05)。

由表 3所示, Cu-HMA組HSI、VSI顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05)。銅源各組間CF均無顯著差異(P＞0.05)。

表 2 銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能的影響Tab. 2 Effects of Cu sources on growth performance of juvenile pearl gentian grouper

2.2 珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚體成分和脊椎骨礦物元素含量

在飼料中添加3種銅源顯著影響全魚水分以及粗脂肪含量(P＜0.05, 表 4)。CuSO4組和Cu-Gly組全魚水分無顯著差異(P＞0.05), 但是顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05); Cu-HMA組粗脂肪含量顯著高于CuSO4組(P＜0.05)。

Cu-Gly組和Cu-HMA組全魚鐵含量無顯著差異(P＞0.05), 但是顯著高于CuSO4組(P＜0.05);CuSO4組全魚鋅含量顯著低于Cu-Gly組(P＜0.05),Cu-HMA組與其他兩組相比無顯著差異(P＞0.05);全魚銅、錳含量不受飼料銅源的影響, 各組之間無顯著差異(P＞0.05, 表 5)。

Cu-HMA組脊椎骨銅和鋅含量顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05), Cu-Gly組脊椎骨銅、鋅含量顯著高于CuSO4組(P＜0.05); Cu-Gly組脊椎骨鐵含量顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05), Cu-HMA組脊椎骨鐵含量顯著高于CuSO4組(P＜0.05); Cu-Gly組和Cu-HMA組脊椎骨錳含量無顯著差異(P＞0.05), 但是顯著高于CuSO4組(P＜0.05, 表 6)。

珍珠龍膽石斑魚幼魚養殖水體中, 礦物質銅、鐵、錳、鋅四種元素含量較低。各組間銅、鐵、錳、鋅含量均無顯著差異(P＜0.05, 表 7)。

2.3 珍珠龍膽石斑魚幼魚血清生化指標和肝臟抗氧化酶活性

CuSO4組血清TG和LDLC顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05), Cu-Gly組和Cu-HMA組相比TG和LDLC無顯著差異(P＞0.05)。CuSO4組血清HDLC顯著低于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05),Cu-Gly組和Cu-HMA組相比HDLC無顯著差異(P＞0.05)。CuSO4組血清CP含量顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05), Cu-Gly組血清CP活性顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05, 表 8)。

表 3 銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚形態學指標的影響Tab. 3 Effects of Cu sources on morphological characteristics of juvenile pearl gentian grouper

表 4 珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚體成分分析Tab. 4 Analysis of Cu sources on whole body compositions of juvenile pearl gentian grouper

表 5 銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚銅、鐵、錳、鋅含量的影響Tab. 5 Effects of Cu sources on Cu, Fe, Mn and Zn contents in whole fish body

表 6 銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚脊椎骨銅、鐵、錳、鋅含量的影響Tab. 6 Effects of Cu sources on Cu, Fe, Mn and Zn contents in vertebrae of juvenile pearl gentian grouper

表 7 珍珠龍膽石斑魚幼魚養殖水體銅、鐵、錳、鋅含量Tab. 7 Cu, Fe, Mn and Zn content in mariculture water of juvenile pearl gentian grouper

表 8 珍珠龍膽石斑魚幼魚血清生化指標分析Tab. 8 Analysis of Cu sources on serum biochemical indices of juvenile pearl gentian grouper

飼料未顯著影響肝臟MDA、T-SOD和CuZn-SOD活性(P＞0.05, 表 9)。

2.4 珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道形態結構

由表 10所示, Cu-HMA組前腸、中腸和后腸PH顯著高于CuSO4組和Cu-Gly組(P＜0.05), Cu-Gly組中腸和后腸PH顯著高于CuSO4組(P＜0.05)。Cu-Gly組前腸和后腸PW顯著高于CuSO4組和Cu-HMA組(P＜0.05), CuSO4組前腸和后腸PW顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05); CuSO4組中腸PW顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組(P＜0.05)。在飼料中添加3種銅源對中腸MT未產生顯著影響(P＞0.05), Cu-Gly組前腸和后腸MT顯著高于CuSO4組和Cu-HMA組(P＜0.05), CuSO4組前腸和后腸MT顯著高于Cu-HMA組(P＜0.05)。腸道切片顯示, Cu-Gly組和Cu-HMA組杯狀細胞顯著多于CuSO4組(圖1—3)。

3 討論

3.1 飼料銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚生長性能的影響

不同形式的銅源在分子結構、分子量、溶解度、吸收方式以及飼料中的干擾物質等方面均存在差異[18,19]。無機銅易與飼料中的植酸和粗纖維絡合成沉淀而影響銅的吸收, 而氨基酸銅可以氨基酸或肽的轉運途徑通過小腸絨毛刷狀緣被吸收[19],因此, 無機銅的吸收利用程度低于氨基酸螯合銅[20]。喬永剛[21]研究發現以WGR和SGR為評價指標, 軍曹魚(Rachycentron canadum)對蛋氨酸銅的生物利用率是CuSO4的1.53倍和1.8倍。氨基酸銅比無機銅能更有效地能促進點帶石斑魚[11]、吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)[22]、俄羅斯鱘(Acipenser gueldenstaedtii)[23]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[24]、花鱸(Lateolabrax japonicus)[25]等魚類的生長, 在本試驗中Cu-Gly組和Cu-HMA組WGR、SGR顯著高于CuSO4組也印證了這一點。然而, 在飼料中添加氨基酸銅和CuSO4并未對異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)[26]和花鱸[25]WGR和SGR產生顯著影響,可能與飼料組成、魚體對銅源的耐受量等因素有關。

軍曹魚[21]、俄羅斯鱘[23]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[27]攝食含氨基酸銅的飼料, 其骨骼中銅的含量遠遠高于其他組織中銅的含量, 表明骨骼對銅具有較強的累積作用。珍珠龍膽石斑魚幼魚全魚銅含量不受添加銅源的影響, 但是脊椎骨中銅的含量以氨基酸螯合銅組(Cu-HMA組和Cu-Gly組)最高。礦物質的交互作用可能表現為對于腸道吸收或運輸結合位點的競爭、酶活性位點的替代或礦物質正常代謝過程中的相互促進。Cu-Gly組和Cu-HMA組全魚、脊椎骨鋅、鐵含量顯著高于CuSO4組, 說明氨基酸銅在吸收方面不僅避免了其他礦物元素的競爭, 還能有效提高鋅和鐵的沉積。

銅作為參與機體代謝眾多酶的輔助因子, 能顯著影響哺乳動物的脂肪沉積[22]。飼料中不同銅源對閹牛血清CHOL、TG、HDLC和LDLC均無顯著影響無顯著影響, 但是攝食無銅組飼料的閹牛血清HDLC和LDLC均顯著高于銅源組[28]。賴氨酸銅比五水硫酸銅更有效地降低北京鴨血漿TG[29]。在本實驗中, 飼料中銅源對珍珠龍膽石斑魚血清CHOL未產生顯著影響, 氨基酸銅可顯著降低石斑魚血清TG和LDLC含量, 提高血清HDLC含量, 提示氨基酸銅有利于TG轉運至靶組織參與能量代謝或者進入脂肪組織儲存。在本實驗中攝食Cu-HMA的石斑魚全魚粗脂肪含量顯著高于CuSO4組, 也表明飼料中不同銅源會影響魚體脂肪的含量。

表 9 銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響Tab. 9 Effects of Cu sources on liver autioxidant enzyme activities of juvenile pearl gentian grouper

3.2 三種銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚抗氧化酶指標的影響

圖 1 銅源對珍珠龍膽幼魚前腸發育的影響(HE染色, 10×)Fig. 1 Effects of dietary copper sources on histomorphology of the foregut intestine in ♀E. fuscoguttatus×♂E. lanceolatu (HE stain, 10×)雙向箭頭. 肌層厚度; 弧形箭頭. 皺襞寬; 曲線雙向箭頭. 皺襞高; 單向箭頭. 杯狀細胞; a. CuSO4組; b. Cu-Gly組; c. Cu-MHA組Double-headed arrow: muscle thickness; Cambered arrow: plica width; Double-headed curved arrow: plica height; Single-headed arrow:goblet cell; a. CuSO4 group; b. Cu-Gly group; c. Cu-MHA group

圖 2 三種銅源對珍珠龍膽幼魚中腸發育的影響(HE染色, 10×)Fig. 2 Effects of dietary copper sources on histomorphology of the midgut intestine in ♀E. fuscoguttatus×♂E. lanceolatu (HE stain, 10×)

CP是動物體內的一種含銅的糖蛋白, 可調節銅在組織中的分布, 調節機體組織中脂質過氧化物如MDA及自由基的產生[9,30], 還參與銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)的組成, 參與機體抗氧化。Shao等[9]得出異育銀鯽血漿T-SOD和CuZn-SOD活性不受飼料銅源的影響。同樣, 在本實驗中石斑魚肝臟T-SOD和CuZn-SOD活性亦不受銅源的影響。然而, 相比于CuSO4或堿式氯化銅, 異育銀鯽[9]和俄羅斯鱘幼魚[23]攝食氨基酸螯合銅可獲得較高的血漿CP活性和肝臟CuZn-SOD活性, 同時MDA含量較低, 具有更好的抗氧化作用。在飼料中分別添加4.54和6.34 mg/kg的蛋氨酸銅和CuSO4對俄羅斯鱘具有相同的抗氧化效果[23]。但是, 本實驗CuSO4組血清CP活性顯著高于Cu-Gly組和Cu-HMA組, 飼料不同的銅源對石斑魚肝臟SOD活性和MDA含量沒有顯著影響。

圖 3 三種銅源對珍珠龍膽幼魚后腸發育的影響(HE染色, 10×)Fig. 3 Effects of dietary copper sources on histomorphology of the hindgut intestine in ♀E. fuscoguttatus×♂E. lanceolatu (HE stain, 10×)

3.3 三種銅源對珍珠龍膽石斑魚幼魚腸道形態的影響

腸道作為營養物質消化和吸收的主要場所, 其良好的生長發育是養分被充分消化、吸收和利用的基本保障[31,32]。魚類腸黏膜PH是腸道吸收營養物質能力的標志[33], MT的增加可以提高小腸吸收營養物質的表面積, 改善腸道消化和吸收能力[34—37]。銅在機體內的穩態主要通過腸道吸收來調節[38], 而魚類對飼料銅的吸收主要發生在幽門、中腸和后腸[26]。不同來源的銅對腸道的發育影響不同, 相對于CuSO4組, Cu-Gly可改善小鼠腸道絨毛長度和絨毛厚度[38]; 蛋白螯合銅組生長肥育豬十二指腸、空腸上皮細胞絨毛高度、絨毛寬度有升高趨勢[39]; 載銅蒙脫石顯著提高了羅非魚前腸、中腸、后腸絨毛和微絨毛高度[40]。在本實驗中Cu-HMA和Cu-Gly能提高珍珠龍膽石斑魚中、后腸的PH、MT和PW, 表明氨基酸銅對腸道PH、PW和MT有積極的改善作用, 從而提高魚類的生長和飼料利用率。

4 結論

在本實驗條件下, 在飼料中添加Cu-Gly和Cu-HMA能顯著影響珍珠龍膽石斑魚幼魚的生長及血清脂質代謝。銅源不影響全魚銅的沉積, 而Cu-Gly和Cu-HMA則有利于脊柱骨銅的沉積, 且后者的作用效果更好。銅源顯著影響中、后腸皺襞高度, 有利于腸道的消化吸收。