同時蒸餾萃取結合氣質聯用分析牦牛酥油中特征揮發性物質

扎西窮達，劉吉愛，曹葉偉，王軍

1(西藏自治區食品藥品檢驗研究院，西藏 拉薩，850000) 2(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京，100083)

酥油在藏族人民飲食結構中扮演著重要的角色[1]。牦牛酥油是牦牛乳發酵后提煉得到的，具有獨特的風味和豐富的營養，深受藏族同胞的喜愛[2-3]。在青藏高原地區，每年7～9月盛產牦牛酥油，具有獨特的口感和香氣。牦牛酥油的營養價值高，又具有一定的特殊功能，越來越受到國內外學者的關注。目前有關牦牛酥油中功能脂肪酸和揮發性風味物質的相關研究很多[4]。其中，研究發現西藏牦牛酥油中的游離脂肪酸含量明顯高于其他奶類脂肪，藏牦牛酥油中的亞麻酸比普通奶油高3倍[6]，亞油酸是普通奶油的2倍多[7-8]，二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA) 僅存于牦牛酥油中[5]。對牦牛酥油揮發性風味物質的研究，主要集中在利用固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)富集后利用氣相色譜-質譜聯用進行定性分析。薛璐等采用固相微萃取頂空氣相-質譜法測定了內蒙酥油中的風味物質，在內蒙古酥油中共檢出22種揮發性風味物質[9]。HU等[10]和魯玉俠等[11]利用氣相色譜-質譜聯用技術在牦牛酥油中鑒定出了28種不同的風味物質等。牦牛酥油風味獨特，但仍然缺乏其揮發性風味物質與普通奶油之間的差別分析，以及是否含有特征風味成分的研究報道。牦牛酥油經發酵而成，與其他奶油加工工藝不同[12]，具有獨特風味。但僅從外觀形狀和色澤無法將其與其他奶油類樣品進行區分，因此市場上存在著將其他奶油類產品與牦牛酥油混淆的情況。因此，需要研究牦牛酥油與其他奶油產品間揮發性物質的差異，尋找它們之間的關鍵的差別物質，為區分牦牛酥油與其他奶油制品提供依據。

同時蒸餾萃取法(simultaneous-distextraction, SDE)在食品揮發性風味物質的研究具有較好重復性，操作簡便、富集效果好、受基質影響小[13-15]。本研究利用同時蒸餾萃取法對牦牛酥油中揮發性物質進行提取和富集，再利用氣相色譜-質譜儀進行分析，對牦牛酥油和其他奶油類樣品中的揮發性物質進行分析比較，尋找牦牛酥油中存在的特征揮發性物質，并對其進行定量分析。

1 材料

1.1 試驗材料

試驗材料如表1所示。

1.2 實驗儀器、標準對照品和試劑

7890B-597氣相色譜-質譜聯用儀分析色譜儀，美國安捷倫公司；同時蒸餾萃取裝置，安徽東冠設備有限公司；恒溫電熱套，力辰科技；旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；萬分之一天平(感量0.000 1g)，英國Adam公司。

標準對照品：乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，北京百靈威科技有限公司；戊酸乙酯、TCI，化成工業發展有限公司。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

試劑：二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷(色譜純)，北京百靈威科技有限公司；無水Na2SO4(分析純)，北京康普匯維科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1 定性分析樣品制備

稱取20 g樣品于圓底燒瓶中，加蒸餾水50 mL，并加入少許沸石，在萃取瓶中加入50 mL萃取溶劑乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷)，裝入同時蒸餾萃取裝置，設置恒溫電熱套溫度，使兩端萃取瓶溫度處于微沸狀態，蒸餾萃取一定時間后冷卻，然后將萃取液用無水Na2SO4干燥去水，旋轉蒸發濃縮至1 mL左右，再用萃取溶劑定容至2.0 mL,用0.22 μm有機相濾膜過濾后進行GC-MS分析。

2.1.2 定量分析樣品制備

準確稱取20 g樣品(精確到0.1 mg)于圓底燒瓶，加蒸餾水50 mL，并加入少許沸石，在萃取瓶中加入50 mL二氯甲烷，裝入同時蒸餾萃取裝置，設置恒溫電熱套溫度，兩端萃取瓶溫度處于微沸狀態，蒸餾萃取4 h，冷卻后，然后將萃取液用無水Na2SO4干燥去水，旋轉蒸發濃縮至1 mL左右，加入20 μL 1 mg/mL戊酸乙酯(內標)，用二氯甲烷定容到2.0 mL，用0.22 μm有機相濾膜過濾后用GC-MS進行定量分析。

2.1.3 標準對照品制備

標準工作液：準確量取乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯標準溶液，用二氯甲烷稀釋至刻度，制成質量濃度為1 mg/mL的標準工作溶液。

內標標準工作液：準確量取戊酸乙酯液，用二氯甲烷稀釋至刻度，制成質量濃度為1 mg/mL的內標工作液。

2.1.3.3 標準曲線的制備:精密量取上述標準工作液，用二氯甲烷稀釋至1.0 mL，制成質量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL的標液，加入的內標質量濃度為10 μg/mL。

2.2 儀器條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱：DB-wax柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃；流速：1.5 mL/min；柱溫：40 ℃保持4 min，5 ℃/min上升到100 ℃保持2 min，3 ℃/min上升到150 ℃，10 ℃/min上升到230 ℃保持8 min；進樣量：1 μL；進樣方式：分流模式(分流10∶1)。

2.2.2 質譜條件

2.2.2.1 定性分析質譜條件

接口溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：SCAN；電離方式：EI。

2.2.2.2 定量分析質譜條件

接口溫度：240 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：SIM；電離方式：EI；定量分析：SIM分析，條件見表2。

表2 SIM分析條件Table 2 The condition of SIM scan

2.3 分析方法

2.3.1 揮發性物質定性分析

通過氣相-質譜儀分析出總離子流圖，通過保留時間和NIST譜庫檢索，選取匹配度均大于800的進行化合物鑒定，該結果為定性結果。

2.3.2 乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯定量分析

樣品經過同時蒸餾萃取后以戊酸乙酯為內標，采用內標法對這3種酯類進行定量分析。

3 結果與分析

3.1 特征揮發性成分定性

3.1.1 萃取溶劑優化

選取酥油1樣品以同時蒸餾萃取法(SDE)萃取揮發性物質，分別用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3種不同極性的溶劑[16-18]萃取，分析對比萃取液GC-MS總離子流圖，酥油1樣品不同萃取液的氣-質聯用分析總離子流色譜圖見圖1。

圖1 采用不同萃取溶劑的SDE方法萃取得到的揮發性物質氣質聯用總離子流色譜圖Fig.1 The total ion chromatogram of volatile compounds by SDE with different extracting solvents

由圖1分析比較得出，3種萃取溶劑中，二氯甲烷溶劑的極性適中，同時蒸餾萃取過程中萃取到的樣品所含的揮發性物質種類最多，色譜峰面積較大，故本方法選用二氯甲烷作為同時蒸餾萃取溶劑，采用SDE法對各種牦牛酥油和其他類奶油制品中的揮發性物質進行定性分析。

3.1.2 牦牛酥油和其他類奶油揮發性成分對比

6種牦牛酥油類樣品和8種奶油類樣品中揮發性物質定性分析見表3。

表3 牦牛酥油和其他奶制品中揮發性物質定性分析Table 3 The qualitative analysis of volatile compounds in yak butter and other similar dairy products

續表3

分類化合物名稱牦牛酥油其他類酥油1酥油2酥油3酥油4酥油5酥油6奶油黃油蛋糕奶油奶酪再制干酪稀奶油植物黃油加鹽黃油酯類丁位十二內酯++----++-+++++丁位十四內酯+-----++--+-++丁位癸內酯++++++++-+++++油酸甲酯--+-----------棕櫚酸甲酯-----------+--亞油酸乙酯--+-----------月桂酸乙酯----+---------酮類2-戊酮++++-+-+------2-己酮--+-----------2-庚酮++++++++++++-+2-壬酮++++++-+++++-+8-壬烯-2-酮--+-----------2-十一酮++++++++++++++2-辛酮--+--+-----+--2-十三酮------+-+-----2-十五酮--------+-----2-十三烷酮++++++-+-+++++2-十五烷酮++++++++-+++++3-羥基-2-丁酮----++---++++-醇類2-戊醇-++--+--------2-庚醇---+++--------正丁醇--------------苯甲醇--+-----------糠醇--+---+--+++--2-壬基醇-----+--------烷類十二烷+---+++-------十四烷--+-+++-------十五烷+-+-+---------十七烷----+----+----十八烷----+--------+十九烷----+---------二十一烷----+---------二十四烷----+---------二十六烷----+---------二十七烷----+---------二十八烷----+------- --醛類壬醛---------+-- --糠醛+--++---+-----苯甲醛--------+-----其他類甲苯++++--++++----苯乙烯-+----+-------N,N-二甲基甲酰胺-+-+--+-+-++--N,N-二甲基乙酰胺-+-+---++-----1,3-二叔丁基苯-----+--------苯胺-----+------++合計343136283325141813141512912

注：“+”表示樣品中檢測到該化合物質，“-”表示樣品中未檢測到該化合物質。

從表3分析看出，牦牛酥油中共鑒定出65種揮發性物質，其中酸類19種，酯類12種，烷類11種，酮類10種，醇類5種，醛類1種，其他類6種；其他類奶油樣品中共鑒定出41種揮發性物質，其中酸類9種，酯類8種，烷類4種，酮類10種，醇類1種，醛類3種，其他類5種。鑒定化合物中酸類和酯類所占比例最高。不同牦牛酥油的制備方法略有不同，所以揮發性風味物質的種類并不完全相同，但大多數含乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯3種酯類，而這些特征性酯類物質在8種其他奶油類樣品中都未檢測到。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯可作為牦牛酥油特征性揮發性物質，這些物質的產生與牦牛酥油制備時特殊的發酵工藝密切相關[19-23]?？蛇M一步通過內標標準曲線建立酥油中這些特征揮發性物質的定量方法，為牦牛酥油的鑒別和品質評價提供參考。

3.2 定量分析方法

3.2.1 萃取時間對定量結果影響

為了探究二氯甲烷萃取溶液是否將牦牛酥油中的特征揮發性物提取完全，對不同蒸餾萃取時間進行優化研究，分別研究1、2、3、4、5、6 h的效果。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在不同萃取時間的提取效果見圖2。

從圖2可看出，在1～4 h內，乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的質量濃度逐漸上升，4～6 h，曲線趨于平穩，表明萃取4 h左右時，可將牦牛酥油中的這3種特征揮發性物質提取完全，故本方法采用4 h蒸餾萃取。

3.2.2 線性關系和檢出限

配制標準溶液質量濃度1.0～50.0 μg/mL，加入內標溶液濃度10.0 μg/mL，采用內標法繪制標準曲線。稱取20.0 g左右樣品，經同時蒸餾萃取后定容至2.0 mL，根據S/N=3分別計算出這3種酯類的檢出限，乳酸乙酯0.13 μg/kg、辛酸乙酯0.18 μg/kg、癸酸乙酯0.17 μg/kg，詳見表4。

表4 標準曲線線性與檢出限Table 4 The standard curve and limit of detection

本方法線性關系R2≥0.997，線性關系良好；檢出限值低，靈敏度高。

3.2.3 準確性和精密度

向酥油1樣品中分別加入0.05、0.02、0.01 mL乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯標準溶液(質量濃度為1.0 mg/mL)，各做3份平行處理，實際加入量為高、中、低3個不同濃度：2.5、1.0、0.5 mg/kg，進行回收率測定，結果見表5。

表5 回收率與相對標準偏差(RSD)(n=3)Table 5 The recovery and relative standard deviation

從表4可以看出，乳酸乙酯回收率在86.7%～104.7%，相對標準偏差(RSD)在1.14%～1.37%；辛酸乙酯回收率在89.3%～105.7%，相對標準偏差(RSD)在0.66%～1.37%；癸酸乙酯回收率在83.3%～89.5%，相對標準偏差(RSD)在0.59%～1.77%。

酥油1號樣品，同時蒸餾萃取處理5份，分析乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量，進一步得到本方法測定的樣品的精密度，結果見表6。

表6 樣品分析相對標準偏差(RSD)(n=5)Table 6 The relative standard deviation of sample analysis

由表6可以看出，方法相對標準偏差乳酸乙酯為1.32%，辛酸乙酯為1.80%，癸酸乙酯為2.08%。本方法具有較好的線性關系，靈敏度高、準確性好，適合牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等特征揮發性成分的定量分析。

3.2.4 牦牛酥油特征性揮發性物質定量分析

用戊酸乙酯做內標物質，對酥油1、酥油2、酥油3、酥油4、酥油5和酥油6六種不同品質的牦牛酥油樣品中的乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯進行定量分析，為了更好的消除基質干擾，準確定量，根據這3種酯類保留時間和質荷比的差異，采用SIM模式，分3個時間段(6～12 min、12～16 min、16～24 min)掃描，分別對化合物選擇1個定量和定性離子進行分析，圖3為標準品和牦牛酥油樣品中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在SIM模式下的總離子流色譜圖。

A-標準品；B-樣品；1-戊酸乙酯(內標)； 2-乳酸乙酯；3-辛酸乙酯；4-癸酸乙酯圖3 標準品和牦牛酥油樣品SIM掃描離子流色譜圖Fig.3 The SIM chromatogram of standard and yak butter sample

用二氯甲烷同時蒸餾萃取處理牦牛酥油后，采用內標法定量分析，各樣品中乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量見表7。

表7 牦牛酥油特征揮發性物質含量Table 7 The content of characteristic volatile compounds in yak butter

可以看出，牦牛酥油中乳酸乙酯含量范圍在0.54～5.14 mg/kg；辛酸乙酯含量范圍在0.28～2.20 mg/kg；癸酸乙酯含量范圍在0.34～3.84 mg/kg，這與牦牛乳發酵制作酥油的特殊工藝和發酵時間的控制相關。

4 結論

利用同時蒸餾萃取結合氣質聯用分析對牦牛酥油進行分析，發現牦牛酥油中共鑒定出65種揮發性物質，其中酸類19種，酯類12種，烷類11種，酮類10種，醇類5種，醛類1種，其他類6種；其他類奶油樣品中共鑒定出41種揮發性物質，其中酸類9種，酯類8種，烷類4種，酮類10種，醇類1種，醛類3種，其他類5種。牦牛酥油樣品揮發性物質含量高于其他奶制品，且含有乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯這3種酯類，這些特征性酯類物質在其他8種外形相似的奶制品中都未檢測到。作為牦牛酥油中含量較為豐富的特征揮發性物質，乳酸乙酯味道濃厚，苦澀微甜；辛酸乙酯味甜，具有梨香、菠蘿的香味；而癸酸乙酯具有白蘭地醇香[24-31]。

對牦牛酥油復雜基質中這3種特征酯類物質，采用同時蒸餾萃取結合氣質聯用的方法進行定量分析，建立了內標定量分析方法，線性相關系數R2≥0.997，線性范圍1.0～50.0 μg/mL；乳酸乙酯檢出限0.13 μg/kg、回收率86.7 %～104.7%；辛酸乙酯檢出限0.18 μg/kg、回收率89.3 %～105.7%；癸酸乙酯檢出限0.17 μg/kg、回收率83.3%～89.5%；相對標準偏差RSD值<2.1%。方法具有較好的線性,靈敏度、準確性較高，可應用在牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯特征揮發性成分分析中。本檢測方法具有操作簡單、試劑耗用量少、去除復雜樣品基質干擾效果明顯等優點。測定6種牦牛酥油樣品，乳酸乙酯含量范圍在0.54～5.14 mg/kg，辛酸乙酯范圍在0.28～2.20 mg/kg，癸酸乙酯范圍在0.34～3.84 mg/kg。牦牛酥油與其他奶制品間揮發性物質種類與含量存在較明顯的差異，該方法可為區分牦牛酥油與其他相似奶制品、以及評價不同酥油間的風味品質、改善加工工藝提供參考方法。