二甲雙胍對人絨癌JAR細胞上皮-間質轉化和侵襲遷移能力的影響

柳光芬，姚春艷

(1.武警重慶市消防總隊醫院檢驗科，重慶 401120；2.陸軍軍醫軍醫大學第一附屬醫院輸血科，重慶 400038)

人胎盤絨毛癌簡稱絨癌，由滋養層細胞癌變而來，具有高度的增殖和侵襲能力的婦科惡性腫瘤[1]。在前期研究中發現，使用40 mmol/L二甲雙胍可以通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路調控凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達，促進絨癌細胞凋亡[2]。既往研究表明，AMPK/mTOR信號通路也參與調控了腫瘤細胞的上皮間質轉化過程(EMT)，而EMT是導致上皮來源的腫瘤細胞向身體其他器官轉移的重要原因，抑制EMT能夠顯著降低腫瘤細胞的轉移能力，提高患者的遠期生存率[3-6]。人絨癌為滋養層來源的腫瘤，具有高度的侵襲性，因此如何有效抑制其轉移過程是絨癌患者治療的關鍵點。本研究以人絨癌細胞JAR為實驗對象，旨在探討二甲雙胍對絨癌細胞侵襲和遷移能力的影響，并明確EMT通路中上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)等蛋白的變化趨勢和效應方式，為二甲雙胍治療絨癌并抑制其轉移提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人胎盤絨毛癌細胞系JAR購置于中國科學院細胞庫。胎牛血清(FBS)購于以色列BI公司；1640培養基購于美國Gibco公司；AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、E-cadherin、 N-cadherin、 Vimentin等蛋白抗體購于美國abcam公司，β-肌動蛋白購于中杉金橋公司。FlouroBlok cell culture transwell小室購于美國Corning公司；Matrigel膠購于美國BD公司。蛋白提取試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天公司。熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀CFX96購于美國Bio-Rad公司；倒置相差顯微鏡TS-100F購于日本Nikon公司；活細胞工作站Cytation 5購于美國Bio-Tek公司；化學發光成像儀G:box 購于美國Gene公司。

1.2 細胞培養 絨癌細胞系JAR使用含10% 胎牛血清和100 U/mL青霉素和鏈霉素的1640培養基培養，放置于5%二氧化碳濃度的飽和濕度培養箱，2～3 d換液，待細胞密度為80%左右時使用0.25%的胰酶消化傳代。二甲雙胍使用前期研究中篩選的最適濃度40 mmol/L處理細胞24 h，隨后進行各項檢測，以添加二甲雙胍做處理的細胞為實驗組，未做任何處理的細胞為對照組。

1.3 劃痕實驗檢測細胞遷移 將JAR細胞接種于6孔板中，待細胞融合度大于80%時使用200 μL槍頭垂直于細胞生長面劃出等寬度整齊無細胞帶，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次以去除細胞碎片。隨后加入終濃度40 mmol/L的二甲雙胍到處理細胞，使用倒置顯微鏡采集培養0、6、12、24 h時圖像。觀察各細胞遷移情況，隨機測量5點垂直于劃痕方向的寬度，計算5點的均值作為實驗的初始劃痕寬度值并計算細胞遷移速率。細胞遷移速率(%)=(初始劃痕寬度值-相應點劃痕寬度值)/初始劃痕寬度值×100%。

1.4 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 使用FlouroBlok cell culture transwell小室，在上室的膜上鋪50 μL的基質膠并待其凝固。使用Hocheest33242染色貼壁JAR細胞，然后使用胰酶消化并用無血清培養基重懸調整細胞濃度為1×105個/mL。取200 μL接種于上室中并加入終濃度為40 mmol/L的二甲雙胍，下室中加入700 μL含10% FBS的1640培養基持續培養24 h。使用BioTek Cytation5活細胞工作站拍攝24 h時穿過聚對苯二甲酸乙二酯 (PET)膜的細胞圖片，選擇3個復孔計數細胞并計算均值和標準差。細胞遷移實驗不鋪設基質膠，其余步驟和侵襲實驗相同。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測mRNA表達變化 二甲雙胍處理JAR細胞24 h后，提取各組細胞RNA并逆轉錄為cDNA備用。PCR引物使用NCBI網站上Primer-BLAST進行設計，引物序列見表1，使用Syber-green法檢測的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和AMPK的mRNA表達水平，并用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。把對照組mRNA的表達量設為1，根據2-ΔΔCt計算實驗組mRNA相對表達量的變化。

表1 基因引物信息

1.6 免疫蛋白印記法檢測蛋白變化 提取細胞總蛋白后使用二喹啉甲酸(BCA)法對其定量，等量蛋白40 μg上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。AMPK、p-AMPK、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等蛋白抗體濃度均為1∶1 000，GAPDH濃度為1∶2 000。一抗4 ℃過夜后二抗(1:5 000)室溫孵育1 h后采用化學發光法系統顯色，使用Bio-rad軟件分析各條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 二甲雙胍抑制JAR細胞遷移 使用前期實驗篩選的最佳作用濃度40 mmol/L的二甲雙胍處理，發現對照組隨著時間的推移，細胞間的劃痕逐漸愈合；6～12 h的二甲雙胍處理對JAR細胞遷移率無明顯影響和對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；24 h的二甲雙胍能夠有效抑制JAR細胞的遷移速率，實驗組和對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2 。

圖1 劃痕實驗檢測對照組和實驗組的遷移能力

注：**P<0.05，與對照組比較

圖2 二甲雙胍對細胞遷移能力的影響

2.2 二甲雙胍處理對細胞侵襲和遷移能力的影響 使用40 mmol/L的二甲雙胍處理熒光標記細胞核并采集穿過PET膜的細胞圖像，進行整板掃描并拼接每個視野以便得到整張PET膜的圖像，使用軟件自動計數分析每張膜上的細胞數。發現侵襲實驗中對照組細胞數為(2 638±337)個，二甲雙胍處理可以減少穿膜細胞數為(1 251±201)個，差異有統計學意義(P<0.05)；遷移實驗中對照組細胞數為(3 341±428)個，二甲雙胍處理能夠顯著抑制遷移過PET膜的細胞數量，對照組穿膜細胞數為(1 852±324)個，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、4。

注：A.對照組遷移；B.對照組侵襲；C.實驗組遷移；D.實驗組侵襲

圖3 Transwell小室檢測對照組和實驗組侵襲和遷移能力

2.3 二甲雙胍調控侵襲遷移相關基因表達 使用熒光定量PCR檢測二甲雙胍處理前后可能參與腫瘤細胞侵襲和遷移能力的相關基因mRNA的表達。發現二甲雙胍能夠增加AMPK的mRNA表達(P<0.05)，同時顯著上調EMT相關基因E-cadherin(P<0.05)；下調N-cadherin(P<0.05)和Vimentin(P<0.05)的表達，提示二甲雙胍能夠調控EMT相關基因mRNA表達。見圖5。

注：*P<0.05，與對照組比較；**P<0.05，與對照組比較

圖4 二甲雙胍處理對細胞侵襲和遷移能力的影響

注：**P<0.05，與對照組比較

圖5 二甲雙胍對AMPK和EMT相關基因mRNA表達的影響

圖6 實驗組和對照組的蛋白表達變化

注：*P<0.05，與對照組比較；**P<0.05，與對照組比較

圖7 二甲雙胍對AMPK和EMT相關蛋白表達的影響

2.4 二甲雙胍調控侵襲遷移相關蛋白表達 使用免疫蛋白印記法技術檢測二甲雙胍處理前后參與腫瘤細胞侵襲和遷移能力的相關蛋白的變化情況。發現其AMPK總蛋白水平沒有明顯變化，促進AMPK Thr172位點的磷酸化(P<0.05)；同時上調EMT相關蛋白E-cadherin(P<0.05)，下調N-cadherin (P<0.05)、Vimentin(P<0.05)的表達，從而抑制上皮間質轉化的過程。見圖6、7。

3 討 論

人絨癌細胞系JAR是一種胚胎滋養層上皮來源并且具有高度的侵襲能力惡性腫瘤細胞，其患者最終往往死于腫瘤細胞的腦轉移，有報道指出EMT可能是主導絨癌細胞侵襲和轉移的主要因素[7]。在前期研究中發現二甲雙胍可以促進絨癌細胞凋亡的發生[2,8]，并初步闡明其通過AMPK/mTOR信號通路調控絨癌細胞凋亡的分子機制。進一步分析文獻發現，AMPK可以抑制EMT過程并逆轉腫瘤細胞的間質表型[9-10]，從而抑制腫瘤細胞的轉移。因此，本研究擬探索二甲雙胍對絨癌細胞EMT，遷移和侵襲能力的影響及可能的分子機制，以期為二甲雙胍的抗腫瘤治療提供新的思路和方法。

侵襲和轉移的能力是腫瘤細胞典型特征之一[11]，也是惡性腫瘤難以根治的原因，在此過程中EMT扮演著十分重要的角色。有研究表明，E-cadherin向 N-cadherin轉化是EMT發生的重要機制，E-cadherin下調或缺失會導致上皮細胞極性消失、細胞間的黏附能力減弱，從而獲得間質細胞表型[12-13]。E-cadherin和 N-cadherin這種此消彼長的關系隨著腫瘤病理分級的增高非常明顯[14]。Vimentin也是EMT的重要標志物，Vimentin只在間質細胞中特異表達，因此腫瘤細胞表達Vimentin則提示其為間質細胞腫瘤。本研究發現，二甲雙胍能夠上調E-cadherin，同時下調N-cadherin和Vimentin蛋白的表達，抑制絨癌JAR細胞遷移和侵襲能力。提示二甲雙胍可以通過逆轉絨癌JAR細胞EMT的表型從而抑制其轉移的發生。

二甲雙胍是一種臨床上常用的AMPK激活劑，本研究發現，其在抑制絨癌JAR細胞EMT的過程中，促進了p-AMPK Thr172的磷酸化。AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠增加細胞的分解代謝從而產生大量ATP，因此AMPK信號通路是非常經典的細胞代謝調控通路[15]。目前，多項研究表明二甲雙胍激活AMPK后能夠通過多種下游調節因子影響腫瘤細胞的EMT過程：在甲狀腺癌中mTOR處于活化狀態，經過二甲雙胍處理能夠抑制mTOR及其下游p70s6k和4E-BP1的磷酸化，從而抑制EMT過程[16]。此外二甲雙胍也通過mTOR下調腎癌細胞自噬而達到抑制EMT的作用[17]；另一方面，二甲雙胍激活AMPK后可以抑制ERK信號通路的活化，影響SNAI家族成員snail和slug的表達從而上調E-cadherin進而抑制EMT的發生[18]；二甲雙胍還能夠激活AMPK并影響細胞內部活性氧及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase 4)，從而抑制細胞EMT的進程，活化后的AMPK還能夠抑制TGF-β、血管收縮素2、醛固酮及清蛋白等誘導的EMT[19]。

4 結 論

本研究發現，二甲雙胍能夠抑制絨癌JAR細胞株侵襲和遷移的能力。其可能涉及的分子是二甲雙胍使AMPK磷酸化激活，上調E-cadherin并下調N-cadherin和Vimentin，以實現逆轉EMT的發生。結合前期研究中二甲雙胍通過AMPK/mTOR通路促進絨癌細胞凋亡，提示二甲雙胍促進絨癌細胞凋亡、抑制侵襲和轉移，為下一步臨床試驗提供了理論和實驗基礎。