自身抗體及生化指標在原發性膽汁性肝硬化診斷中的應用

張佳婕，蔡 強，鄧紅艷，李引鈺，薛富海，盛尚春△

(1.成都大學附屬醫院檢驗科，四川成都 610081；2.宜賓市第二人民醫院兒科，四川宜賓 644000)

原發性膽汁性肝硬化(PBC)，又稱為原發性膽汁性膽管炎，是慢性自身免疫性肝臟疾病的一種，其病因不明，主要特點是肝內膽管進行性破壞，從而導致膽汁淤積，并可進展為肝硬化或肝功能衰竭，甚至是肝細胞癌[1]。PBC一般可分為臨床前期、無癥狀期、癥狀期和失代償肝硬化期4個階段，該病可從無癥狀期遷延數年甚至數十年[2]。大約20%的PBC患者早期表現為疲勞和瘙癢[3]，由于該病早期癥狀與病毒性肝炎相似，且二者都可能出現血清生化指標異常，故常容易漏診或誤診。目前，該病尚無理想的治療方法，疾病早期使用熊去氧膽酸(UDCA)可以改善血清生化指標延緩病情[4]，但是約三分之一的患者對UDCA表現為不耐受，而在失代償期常規治療手段已無力，只有肝臟移植才能挽救患者生命[5]，所以對該病的診斷和治療越早越好。目前，已公認PBC患者血清中常常出現抗線粒體抗體(AMA)，尤其以M2型抗體(AMA-M2)陽性為主要特征[5]。因此，檢測出PBC的特異性自身抗體和生化指標的變化對診斷和進一步治療有重要作用。本研究旨在探討自身抗體及生化指標在PBC診斷中的價值，為臨床診斷提供實驗室依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據臨床診療結果及實驗室檢測指標進行回顧性分析，選取2017年1-12月成都大學附屬醫院住院治療的PBC患者41例作為PBC組，其中男6例(14.63%)，女35例(85.37%)，年齡38～88歲，平均(56.24±14.72)歲。另收集病毒性肝炎患者65例作為病毒性肝炎組，包括乙型肝炎35例，丙型肝炎18例，戊型肝炎6例，甲型肝炎6例，其中男29例(44.62%)，女36例(55.38%)，年齡26～88歲，平均(54.28±17.69)歲。同期在醫院體檢健康者50例作為健康對照組，其中男21例(42.00%)，女29例(58.00%)，年齡20～76歲，平均(50.92±16.02)歲。各組性別和年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例納入診斷標準 PBC的臨床診斷：參照2009年美國肝病研究協會(AASLD)對PBC的診斷建議[6]。符合3個標準中的兩項則可診斷PBC:(1)反映膽汁淤積的生化指標如堿性磷酸酶(ALP)升高；(2)患者血清AMA或AMA-M2陽性；(3)患者血清AMA及AMA-M2陰性，但肝穿刺病理符合PBC。慢性乙型肝炎的診斷符合2015年慢性乙型肝炎防治指南[7]；丙型肝炎的診斷符合2015年丙型肝炎防治指南[8]；戊型肝炎和甲型肝炎的診斷分別符合戊型病毒性肝炎診療規范[9]和甲型病毒性肝炎診斷標準[10]。

1.3 儀器與試劑 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡、EUROBlotMaster 44半自動免疫印跡儀、EUROLINEScan掃描儀、OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀。間接免疫熒光法采用歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司生產的自身抗體譜IgG檢測試劑盒。免疫印跡法檢測試劑采用歐蒙(杭州)醫學實驗診斷有限公司生產的抗肝抗原譜抗體IgG試劑盒。生化指標采用中生北控生物科技有限公司生產的相應檢測試劑盒。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集 符合上述標準的人群采用真空血清采血管按常規采血步驟采空腹血3 mL，1 h內以3 000 r/min離心10 min，血清完全分離后檢測。

1.4.2 間接免疫熒光法 自身抗體譜IgG試劑生物載片上包被4種基質抗原：Hep-2細胞(人)、猴肝、大鼠胃、大鼠腎，可檢測抗核抗體(ANA)、AMA、抗平滑肌抗體(ASMA)和抗肝腎微粒體抗體(LKM)。按照試劑盒說明書操作，每批次均設置試劑盒自帶的陰性對照和陽性對照，在熒光顯微鏡下觀察特異性綠色熒光，血清稀釋度≥1∶100判斷為陽性。

1.4.3 免疫印跡法 抗肝抗原譜抗體IgG試劑盒可檢測AMA-M2、2-酮酸脫氫酶復合體(M2-3E，又名BPO)、肝腎微粒體抗體(LKM-1)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(SLA/LP)、抗肝細胞溶質抗原1型(LC-1)抗體。血清1∶100稀釋，用EUROBlotMaster 44半自動免疫印跡儀按照試劑盒說明書操作，每批次均設置陰性對照和陽性對照，實驗結果通過掃描儀掃描膜條，用EUROLINEScan軟件判斷陰陽性。

1.4.4 酶比色法 OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、ALP、γ-谷氨?；D移酶(GGT)、總膽紅素(TBil)和膽汁酸(TBA)。所有實驗步驟均按照說明書嚴格操作。

1.5 統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行統計學處理。計數資料以例數或百分比表示，陽性率比較采用χ2檢驗；計量資料偏態分布，以[M(P25,P75)]表示，兩個獨立樣本的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 熒光核型檢出率 PBC組ANA陽性率為97.50%，其中10例(24.39%)熒光強度為1∶100，23例(56.10%)熒光強度為1∶320，7例(17.07%)熒光強度為大于或等于1∶1 000。熒光核型以核顆粒型和胞漿顆粒型為主,檢出的核型分別為胞漿顆粒型56.10%(23/41)、核顆粒型21.95%(9/41)、著絲點型7.32%(3/41)、核膜型7.32%(3/41)和核點型4.88%(2/41)。見圖1。以上單一核型占75.61%(31/41)，混合核型占21.95%(9/41)，分別為核顆粒型與胞漿顆粒型混合(3/41)、核膜型與胞漿顆粒型混合(4/41)、核顆粒型與著絲點型混合(2/41)。病毒性肝炎組和健康對照組ANA為低滴度(1∶100)核顆粒型。PBC組ANA及AMA陽性率高于病毒性肝炎組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，病毒性肝炎組與健康對照組ANA與AMA比較，以及ASMA和LKM各組間兩兩比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組間接免疫熒光法檢測結果比較[n(%)]

2.2 相關自身抗體檢出率 PBC組AMA-M2、M2-3E檢出率分別與病毒性肝炎組、健康對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；病毒性肝炎組與健康對照組AMA-M2與M2-3E比較，以及LKM-1、SLA/LP、LC-1各組間兩兩比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。PBC組至少1種抗體為陽性的患者占92.68%(38/41)，1例患者表現為AMA-M2和SLA/LP同時陽性。見表2。

注：A核顆粒型；B核點型；C核膜型；D著絲點型；E胞漿顆粒型；F核顆粒+胞漿顆粒型；G核膜+胞漿顆粒型；H核顆粒+著絲點型

圖1 PBC患者ANA熒光核型

2.3 各組生化指標檢測結果比較 PBC組GGT、ALP水平顯著高于病毒性肝炎組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組間其余指標ALT、AST、TBil、TBA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。PBC組、病毒性肝炎組與健康對照組ALT、AST、GGT、ALP、TBil和TBA水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。PBC組中，AMA-M2陰性組和AMA-M2陽性組之間生化指標比較，M2-3E陰性組和M2-3E陽性組之間生化指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 各組生化指標檢測結果比較[M(P25,P75)]

續表3 各組生化指標檢測結果比較[M(P25,P75)]

注：U1(P1)值為PBC組與病毒性肝炎組比較；U2(P2)值為PBC組與健康對照組比較；U3(P3)值為病毒性肝炎組與健康對照組比較

表4 PBC組中各亞組生化指標比較[M(P25,P75)]

3 討 論

流行病學調查表明PBC主要發病的人群為中年女性，男女發病比例為1∶12[5]。PBC患者有兩類自身抗體，ANA類和AMA類，包括AMA-M2等亞型[11]。雖然ANA是非特異性自身抗體，但有些熒光核型可高頻率出現在某些疾病中，因此，ANA的檢測在許多自身免疫性疾病的診斷中起著重要的作用[12]。本研究中ANA陽性率為97.50%，陽性率高出報道28.3%[13]。有研究報道PBC中常見的ANA核型為著絲點型、核膜型和核點型，其中核膜型ANA是PBC的一個特異性血清學指標，它的出現有助于PBC的診斷[14]。本研究中ANA核型依次是胞漿顆粒型、核顆粒型、著絲點型、核膜型和核點型，與上述報道不一致，與周曉冬等[4]的報道基本相符。本研究中單一核型與混合核型比為31∶9，與王晗等[15]報道的混合核型高于單一核型不符，混合型的出現可能與重疊綜合征有關。上述結果分析原因， 10名(24.39%)患者中查見1∶100低滴度熒光核型都是胞漿顆粒型和核顆粒型，可能與實驗本底偏高或者與人員判讀差異有關，導致熒光滴度偏高，出現ANA假陽性和熒光核型的差異，也可能與實驗方法、試劑、地域、人種差異及患者治療階段藥物的影響有關。此外，核膜型ANA靶抗原是gp210，核點型ANA靶抗原是sp100，并且二者主要出現在AMA陰性PBC患者體內[11]，本研究間接免疫熒光法檢測AMA陽性率為73.17%，僅有26.83%患者AMA是陰性，故檢測到的核膜型和核點型ANA數量相對較少。此外，其他自身免疫性疾病患者、伴有腫瘤、內分泌性疾病等其他基礎疾病患者甚至健康老年人體內也可查見低滴度ANA，因此，高熒光強度ANA提示患者可能有自身免疫性疾病，可作為PBC的篩查指標。

AMA可在多種自身免疫性疾病和感染性疾病中出現[16]，但其主要存在于PBC患者體內。AMA有9個亞型，其中4個與PBC相關聯：AMA-M2，AMA-M4，AMA-M8和AMA-M9，其中95%的PBC患者中可發現AMA-M2[17]。AMA-M2是診斷PBC的標志性抗體，甚至在缺乏臨床癥狀，無膽汁淤積，或者是ALP水平正常的情況下，也可檢出AMA-M2，因此，有學者提出將AMA-M2直接作為PBC的診斷標準[18]。BPO是由天然M2抗體的靶抗原丙酮酸脫氫酶復合體E2 亞基(PDC-E2)與酮戊二酸脫氫酶復合體E2 亞基及丙酮酸脫氫酶復合體側鏈E2 亞基三者組成的融合蛋白[11]。研究報道AMA-M2和M2-3E陽性率分別為70.31%和81.25%[4]，本研究中二者陽性率比以上報道高，但M2-3E陽性率(85.37%)比AMA-M2陽性率(80.49%)高與文獻[4]報道結果相符。因此AMA-M2與M2-3E聯合檢測可提高PBC的陽性率，尤其是M2-3E單獨陽性患者要高度懷疑PBC，最好結合肝組織活檢有利于疾病診斷。若能采用同時包被有AMA-M2、M2-3E、gp210和sp100抗原的條帶進行檢測，更能降低漏診率，提高檢測靈敏度和特異度。本研究中1例患者除了檢出AMA-M2、M2-3E，還檢出了SLA/LP抗體，SLA/LP是診斷AIH的特異性標志物，說明該患者有重疊綜合征。

PBC主要病變是肝內膽管的進行性破壞從而導致膽汁淤積，因此，反映膽汁淤積的生化指標會出現不同程度的升高。病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的以肝臟炎癥和壞死為主的傳染病。本文中PBC組與病毒性肝炎組肝功指標均出現不同程度的升高，說明二者都出現了肝細胞損害，但PBC組GGT及ALP顯著高于病毒性肝炎組，說明PBC患者肝內膽管損害和膽汁淤積更加嚴重。有研究指出，血清ALP升高不僅是肝內膽汁淤積的指標，更可以反應PBC的嚴重程度。也有研究指出ALP、TBil、TBA血清濃度與PBC的發展甚至惡化有顯著聯系[19-21]?？怪z點抗體陽性患者可能出現更高的ALP水平，更易發展為肝硬化、門脈高壓和肝衰竭[22]。有報道指出AMA陽性患者與AMA陰性患者在臨床表現、血清生化特征、組織病理特征、病程進展或對UDCA治療的反應無明顯區別，只是AMA陰性PBC患者的預后更差[17]。本研究比較了AMA-M2陰/陽性組和M2-3E陰/陽性組之間的生化指標，發現AMA-M2、M2-3E與肝功能損害無相關性，與其他研究報道結果相符[4]。

4 結 論

PBC患者可檢測出多種ANA熒光核型，AMA、AMA-M2、M2-3E等自身抗體在PBC患者中有較高檢出率，特別是AMA-M2與M2-3E聯合檢測可提高PBC陽性率，尤其是M2-3E單獨陽性患者要高度懷疑PBC。若上述任何一種抗體單獨出現并且生化肝功指標升高，特別是ALP、GGT顯著升高，都提示可能是PBC早期。此外，要高度重視極少數預后更差的患者，其AMA-M2和/或M2-3E抗體陰性但肝功指標異常升高，需要結合組織病理結果等進一步檢查才能幫助臨床及早對PBC患者作出診斷和鑒別診斷，降低誤診和漏診，使患者得到合理及時的治療，改善預后。