結核病感染期間中性粒細胞CD64、TLR2和TLR4表達變化及其對免疫反應的影響

蔣秀娣,姚曉陽,段愛華,項舟弘

(上海中醫藥大學附屬第七人民醫院檢驗科，上海 200137)

結核病是一種傳染病，通常由結核分枝桿菌(MTB)引起，潛伏性肺結核往往沒有明顯癥狀，其中10%會發展為活動性疾病，危及生命[1]。中性粒細胞是先天免疫系統重要組成部分，屬于多形核細胞家族(PMN)，當機體受MTB感染時，中性粒細胞通過血液向受感染部位遷移，因此其是急性炎癥的標志[2-3]。研究表明，PMN受細胞因子吸引的免疫反應可能與抗結合病細菌感染相關，并在早期感染期間起防御作用[4]。其次，Toll樣受體(TLRs)通常在前體細胞如巨噬細胞和樹突細胞上表達，是一種單跨膜非催化受體，當感染源到達物理屏障如皮膚或腸道黏膜時，它們會被TLRs識別從而激活免疫反應[5]。因此本文就MTB感染期間，中性粒細胞和TLRs表達情況及其對機體免疫反應產生的影響展開研究，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 篩取2016年10月至2018年3月來本院呼吸內科就診的患者作為研究對象；納入標準：診斷為結核病，體質量減輕，持續咳嗽和發燒2周以上，痰涂片抗酸桿菌(AFB涂片)呈陽性；排除標準：糖尿病，艾滋病毒/艾滋病和高血壓的既往史；將符合標準的36例患者納為觀察組。另外，選取同期來本科室就診的38例無結核病患者作為對照組，其中全部患者均無結核病，糖尿病或免疫功能低下癥的既往病史，也無近期發燒和/或持續咳嗽情況。對照組男、女比例為10∶9，年齡20～48歲，平均(30.14±10.76)歲；觀察組男、女比例為10∶8，年齡20～50歲，平均(34.35±10.57)歲；兩組患者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集和處理 分別于清晨8:00前通過靜脈穿刺收集兩組患者肝素化血液。

1.2.2 菌液培養 將本科室保藏MTB接種于酸性羅氏培養基，斜面朝上靜置于37 ℃恒溫培養箱中，每隔3 d觀察1次。長出菌落后，轉接至MGIT960液體培養基(含MGIT雜菌抑制劑)中，A600達到0.8后待用。

1.2.3 中性粒細胞Fcγ受體表達檢測 采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細胞2次，并用于流式細胞術染色方案，通過使用小鼠單克隆抗人抗體CD32(克隆號FLI8.26，eBioscience)-別藻藍蛋白(APC)，CD64(克隆號10.1，eBioscience)-藻紅蛋白花青染色細胞來測定中性粒細胞Fcγ受體CD64和CD32表達。在加入抗體前加入MTB菌液(A600=0.8)30 μL，37 ℃孵育30 min，檢測CD64和CD32表達[6]。

1.2.4 TLRs表達檢測 分別取30 μL兩組患者肝素化血液，加入抗人TLR1-PE(克隆號GD2.F4，eBioscience)、TLR2-PE(克隆號T2.5，eBioscience)和TLR4-PE(克隆號：HTA125，eBioscience)單克隆抗體，孵育30 min后用PBS清洗1次，離心取上清后作為感染前待測樣。在加入抗體前加入MTB菌液(A600=0.8)30 μL，37 ℃孵育30 min，加入上述抗體重復相同操作后獲得MTB感染后待測液。通過QT-PCR檢測TLR1、TLR2和TLR4相對表達量[7]。見表1。

表1 PCR引物

1.2.5 中性粒細胞吞噬能力檢測 取100 μL肝素化血樣做好標記，將5 nmol/L PMA(Sigma，USA)作為陽性對照，向所有管內加入預冷卻的FITC標記大腸桿菌(A600=0.8)，加入100 μL猝滅溶液，然后洗滌，裂解并固定，將細胞懸浮液與染色溶液一起溫育，并在4 ℃下孵育10 min。使用藍綠激發光(488 nm氬離子激光)，通過FACS Calibur流式細胞儀(Becton Dickinson，USA)分析細胞。在加入抗體前加入MTB菌液(A600=0.8)30 μL，37 ℃孵育30 min，再次通過流式細胞儀檢測獲得感染后中性粒細胞吞噬能力結果[8]。

2 結 果

2.1 兩組感染前后中性粒細胞表達比較 兩組感染后CD64表達水平均明顯高于感染前,而且觀察組均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組感染后CD32表達水平明顯提升，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 兩組感染前后TLRs相對表達量比較 對照組感染前TLRs表達水平均明顯低于觀察組，差異有統計學意義(P<0.05)；感染后兩組TLRs表達量均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.3 兩組感染前后中性粒細胞吞噬能力比較 兩組感染前后中性粒細胞吞噬作用百分比均明顯變化，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組感染前吞噬作用百分比明顯高于觀察組，差異有統計學意義(P<0.05)，兩組感染后吞噬作用百分比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖2。

表2 兩組感染前后中性粒細胞表達比較

注：與對照組比較，#P<0.05

圖1 兩組感染前后TLRs相對表達量比較

組別n感染前感染后t1P1對照組3875.00±30.5097.76±4.154.558<0.05觀察組3650.50±15.3098.57±5.1317.873<0.05t24.3300.749P2<0.05>0.05

注：a為對照組；b為觀察組

圖2 兩組中性粒細胞吞噬能力比較

3 討 論

結核病活動期患者可通過咳嗽、吐痰、說話或者噴嚏在空氣中傳播MTB，使周圍人的人收到感染[1,9]。篩選發病高危人群，早期發現并接種卡介苗(BCG)疫苗可避免疾病發生，對于可能患病的患者，需要長期服用多種抗菌藥物進行治療[10]。但抗菌藥物耐藥性是一個日益嚴重的問題，現已發現多重耐藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)發病率在不斷上升[11]。因此針對結核病治療和MTB抑制的研究非常必要，本研究針對MTB感染期間中性粒細胞及其受體、TLRs表達變化，中性粒細胞吞噬作用變化展開研究。

研究表明，在結核感染期間病原體識別的初始階段，中性粒細胞提供顯著的免疫抗性，這表現為對病原體的吞噬作用、細胞凋亡和下游免疫反應的激活等[12]。在吞噬作用中Fcγ受體起重要作用，它們在所有吞噬細胞上表達。在本研究中，觀察兩組感染后各項指標發現，CD64表達水平均明顯高于感染前和同時間段對照組，說明結核病患者外周血中Fcγ受體明顯高于對照組，該受體增加量明顯高于感染MTB者，說明Fcγ受體是參與抗原吞噬作用和相關功能調節。因此，CD64的表達水平用作診斷結核病的額外標志物具有相當重要的意義。

在結核病中，除中性粒細胞Fcγ受體外，TLRs也被認為在MTB識別中起著至關重要的作用。已有報道顯示，結核病患者血液中的中性粒細胞通過TLR2識別MTB[13]。在研究中觀察到MTB感染的中性粒細胞中TLR2的表達增加，概述了中性粒細胞TLR2對MTB菌株的識別和響應。同時，有研究表明當TLR4被阻斷時， BCG感染的CXCL8產生顯著減少[14-15]。在本研究中也觀察到了類似的變化，感染后TLRs表達量均明顯上升，說明TLRs表達受MTB菌株的影響。在實驗中還發現，感染MTB時結核病患者血液中TLRs表達明顯高于對照組，說明中性粒細胞在進一步感染MTB后能夠快速進行TLRs介導的活化反應。對比外周血中中性粒細胞吞噬大腸桿菌能力發現，感染前對照組吞噬作用百分比明顯高于觀察組，表明中性粒細胞由于MTB感染而經歷功能惡化。

雖然研究者強調了中性粒細胞在結核病中診斷的重要性，就目前觀察還可進行深入。下一步可以對TLRs受Fcγ刺激后吞噬作用及其導致的下游信號變化展開研究，進一步了解結核病期間中性粒細胞間修飾為中性粒細胞介導的診斷、藥物設計和治療打下基礎。

總而言之，結核病感染期間，患者外周血中性粒細胞CD64、TLR2和TLR4表達水平均明顯升高，且中性粒細胞吞噬功能下降明顯。