低氧模擬劑預處理提高預構皮瓣成活率的實驗研究

李玢 程辰 李華 昝濤

預構皮瓣是指通過在皮瓣內植入軸型血管，經過一段時間的再血管化后，將隨意皮瓣變為軸型血管皮瓣。皮瓣預構技術不僅能擴大游離皮瓣供區的選擇，還能夠按照一定的設計和構想，將皮瓣改造成具有一定功能和特性的皮瓣，使其更便于修復大面積器官缺損，尤其適合面頸部大面積燒傷后的重建[1]。該技術結合皮膚軟組織擴張器的運用，能夠形成一面積大、厚度薄、色澤質地與頭面部較為接近的軸型皮瓣，用于全面部燒傷的重建[2]。

盡管預構皮瓣已是修復復合缺損的理想手段，但是皮瓣壞死的風險仍是亟待解決的問題。作為人為制造的軸型皮瓣，預構皮瓣的有效血運范圍很難預估，其存活依賴于植入血管與受區組織的再血管化。因此，促進預構皮瓣的再血管化，可提高其存活率并減少并發癥。

許多因素都能促進組織再血管化，組織缺氧是血管新生最重要的刺激因素，血管新生本身就是組織對抗低氧的一種表現。在組織創傷、失血、缺氧等病理狀態下，機體組織的低氧誘導因子（Hypoxia Inducing Factor,HIF）轉錄活性上調，其下游所調控的效應蛋白中有很大一部分是與血管化相關的細胞因子,如VEGF等，可促進機體新生血管，以獲得更多的氧供[3]。而HIF的活性，是由脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase domain-containing enzymes,PHDs）起總調控作用，其中尤以PHD2對HIF-1α的調控最為重要[4]。PHD2是一個能感受環境氧濃度的分子，在亞鐵離子和抗壞血酸的輔助下，可直接感受氧濃度的變化并作出反應，能通過將脯氨酸羥化抑制HIF-1α的活性，發揮一系列重要的生物學效應，如血管新生、紅細胞增多等，來對抗組織的缺血、缺氧狀態，在機體組織氧代謝平衡中起核心調控作用[5]。文獻證實，使用基因治療手段將PHD2基因抑制，可提高細胞HIF-1α轉錄水平，促進血管新生，提高缺血下肢抵抗缺氧的能力，并且這種作用是通過HIF-1α介導的[6]。有研究認為，利用ADSC治療能有效促進預構皮瓣血管化，并觀察到治療后預構皮瓣VEGF水平增高[7]。 去鐵胺（Defetoxamine，DFO）是一種鐵離子螯合劑，而PHD2發揮生物活性需鐵離子作為共同底物，所以螯合鐵離子能夠抑制PHD2的活性[8-9]。文獻證實，利用低氧模擬劑去鐵胺能夠促進隨意皮瓣的成活，降低缺血壞死的發生率，并且組織細胞的VEGF水平和細胞增殖活力在DFO干預后明顯提高[10]。文獻報道，應用PHD抑制劑DMOG在小鼠缺血皮瓣模型上，可觀察到防止皮瓣缺血壞死的治療效果[11]。因此，如能證實DFO促進預構皮瓣血管化，有可能為預構皮瓣更加安全地運用于臨床增添一種輔助手段，有利于預構皮瓣技術在基層醫院的推廣。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

雄性 Wistar大鼠，8～12 周齡，體質量 280～300g（上海斯萊克公司）。所購動物飼養于華東師范大學實驗動物中心（SPF級別），常規分籠飼養。注射用甲磺酸去鐵胺 （商品名得斯芬，Novartis Pharma Stein AG,Switzerland）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠腹部預構皮瓣模型的建立

建立大鼠腹部預構皮瓣模型：一期手術時將股動、靜脈血管束植入腹壁皮下進行預構（圖1）。4周后（二期）掀起以預構的血管束為蒂的島狀皮瓣，原位縫合（圖 2）。

圖1 大鼠腹部預構皮瓣一期手術示意圖Fig.1 Surgical procedures of flap prefabrication on a rat model:stage I

圖2 大鼠腹部預構皮瓣二期手術示意圖Fig.2 Surgical procedures of flap prefabrication on a rat model:stage II

1.2.2 實驗干預及分組

造模成功的大鼠隨機分為 4組 （n=13）：①對照組，無干預；②去鐵胺腹腔注射組：一期術中及術后3 d給予腹腔注射去鐵胺（20 mg/Kg）；③去鐵胺皮下注射組：一期術中及術后3 d在轉位的血管蒂周圍腹部皮下注射去鐵胺（20 mg/Kg）；④延遲組：在二期手術前一周，按照二期手術的切口設計（圖3），將大鼠腹部兩側的縱行皮膚切口切開并原位縫合。

圖3 二期手術前延遲切口示意圖Fig.3 Delay procedure before the 2ndstage operation

1.2.3 預構皮瓣成活率評估

預構皮瓣二期術后即刻，用半透明紙拓下皮瓣面積，作為預構皮瓣的總面積；二期手術后第5～7天，當壞死區域界限明顯時，將大鼠麻醉處死，以半透明紙拓下皮瓣存活面積。皮瓣壞死標準為皮瓣的顏色變黑、組織回縮、質地變硬或液化壞死形成創面。照片用Image Pro Plus軟件分析面積，存活面積除以皮瓣總面積即為皮瓣存活率。

1.2.4 皮瓣微血管密度計數

在評估完皮瓣成活率之后，將皮瓣切下，切取植入的股血管束末端近旁成活的皮瓣組織，在10%中性甲醛緩沖液中固定24 h，而后置于30%蔗糖溶液中脫水48 h，PBS沖洗，75%乙醇浸泡保存。脫水、石蠟包埋，垂直于皮瓣平面連續切片（厚度8 μm，使用防脫片劑），VEGF免疫組化染色，鏡下觀察：每個皮瓣選擇一張靠近皮瓣中間位置的切片，隨機選擇一個視野計數染色陽性的血管數量。

1.2.5 大鼠皮膚成纖維細胞的分離培養

選取出生7 d內的Wistar大鼠，處死后75%乙醇浸泡15 min消毒。將老鼠皮膚浸入0.2%中性蛋白酶溶液中，4℃過夜。次日小心剝除表皮組織，將真皮組織充分切碎，經37℃，0.2%膠原酶充分消化。過濾后離心，重懸沉淀于含10%胎牛血清的高糖培養液中，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。當細胞生長融合達80%～90%時，以1∶3或1∶4的比例傳代。

1.2.6 大鼠皮膚成纖維細胞去鐵胺干預及定量PCR分析

第2代的大鼠皮膚成纖維細胞加入去鐵胺進行聯合培養，培養至80%以上融合時，提取RNA行定量PCR檢測，與單獨培養的成纖維細胞比較。所使用 的 引 物 序 列 如 下 ：NF-KB-Forward，5'CATGCGTTTCCGTT ACAAGTGCGA3'；NF-KB-Reverse，5'TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCTGT3'；ANG-Forward，5'AATGGCTAGACATACCCAGCA3'；ANG-Reverse，5'GCCTAAGCAGTTCACTTCCAC3'；GAPDH-Forward，5'AATGGATTTGGACGCATTGGT3'；GAPDH-Reverse，5'TTTGCACTGGTACGTGTTGAT3'；VEGF-Forward，5'CAACGTCACTATGCAGATCATGCG3'；VEGF-Reverse，5'GGTCTAGTTCCCGAAACCCTGAG3'；PHD2-Forward，5'GATGCCCAGAAGCACGATGT 3'；PHD2-Reverse，5'TAGAGAGTCTCGAACTCGCAG 3'。

1.3 統計分析

使用SPSS 16.0統計軟件進行分析。皮瓣成活率及PCR實驗數據用（x±s）來表示，組間差異比較：當方差齊時，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，多重檢驗校正采用Bonferroni校正，以α=0.05為檢驗水準。皮瓣血管計數采用中位數Median（P25，P75）進行描述，多組間差異比較采用Kruskal Wallis檢驗，兩兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預構皮瓣成活率對比

預構皮瓣二期術后第5天左右，壞死面積已穩定清晰，此時描記皮瓣存活面積，行皮瓣存活率分析，結果顯示：去鐵胺皮下注射和腹腔注射組的皮瓣存活率皆高于對照組（P＜0.001），與延遲組療效相當，且兩種給藥方式的療效無明顯差異（P=0.104）。各組的皮瓣成活率：對照組為26.66%±8.85%；DFO腹腔注射組為 52.48%±11.49%；DFO皮下注射組為60.83%±9.59%；手術延遲組為 51.74%±20.51%（圖4）。

圖4 去鐵胺治療后各組預構皮瓣的成活率(*P<0.001)Fig.4 Comparison of flap survival rate among groups after DFO treatment(*P<0.001)

2.2 預構皮瓣微血管計數對比

鏡下觀察，注射了去鐵胺的實驗組其血管口徑較對照組要粗，而延遲組血管數目明顯多于其他3組，但口徑較細（圖5）。

圖5 大鼠預構皮瓣VEGF免疫組化染色（40×）Fig.5 Immunohistochemistry staining of VEGF for the prefabricated flaps(40×)

各組血管計數的結果使用中位數（P25，P75）進行描述，對照組、腹腔用藥組、皮下給藥組及手術延遲組的血管計數分別為：1（1，2）、3（2，5.5）、5.5（4，7）和20.5（14.25，33）。各組間兩兩比較血管密度計數均有統計學差異（P＜0.05）。

2.3 體外實驗PCR結果

定量PCR結果：經去鐵胺處理的大鼠成纖維細胞，其PHD2的表達明顯降低；同時，促血管化因子HIF-1α、VEGF 和 NF-κ B 的表達明顯上調（圖 6）。

圖6 大鼠皮膚成纖維細胞PCR結果（*P<0.01;**P<0.001）Fig.6 Quantitative-PCR assay of the rat fibroblasts（*P<0.01;**P<0.001）

3 討論

本實驗結果顯示，在預構皮瓣一期手術時應用低氧模擬劑去鐵胺，可促進預構皮瓣的血管化，提高預構皮瓣的生存活力，其效果相當于在預構皮瓣二期手術之前進行了一次延遲手術。這個發現具有很好的臨床價值和意義：首先，實驗中所使用的去鐵胺是臨床已應用多年的藥物，是治療地中海貧血的一線藥物，很多患者需終身用藥，無明顯毒副作用及對重要臟器的損害。因此，相比其他促進血管化的方法（細胞治療、基因治療、細胞因子等），是更加安全、簡便、可行的方法，易于普及，能促進預構皮瓣技術的推廣。其次，臨床上大面積皮瓣轉移之前，為了保證皮瓣的存活，常先給予延遲手術，增強皮瓣血流之后再行皮瓣轉移術，給患者增加了手術痛苦，也多占用了醫療資源，而且由于延遲手術的切口范圍是憑借經驗估計的，有可能在真正的皮瓣轉移術中會發現皮瓣的面積不足以覆蓋受區缺損等尷尬局面，甚至有將皮瓣的重要側支循環切斷，使其失去supercharge增強血流的機會的可能。而本實驗的結果證實預構一期手術時給予去鐵胺，效果相當于二期手術前做了一次延遲。

低氧模擬劑預處理對組織細胞抗缺血缺氧能力的提高在多種動物模型中已有報道，同類研究一般都在組織缺血損傷之前用藥，而本實驗則在一期預構皮瓣的術中及術后用藥。因為預構皮瓣 （一期手術）模型與其他（如下肢缺血、心肌梗死、隨意皮瓣等）缺血模型有一個顯著的不同，即造模后組織不發生壞死，也就是說模型本身對組織造成的缺血、缺氧損傷程度較輕。在其他模型中，若在組織已經發生缺氧損傷后用藥，存在加重組織缺血壞死的顧慮，而在預構皮瓣（一期手術）模型中則不存在這樣的顧慮。相較以往的預構皮瓣動物模型[7,12]，本實驗改進了一期手術的切口設計，使之更符合臨床應用的設計方式，對腹部皮瓣造成的破壞更小，更加不存在術后缺血壞死的可能，所以我們可以在術中甚至術后給予去鐵胺干預，這種差異是動物模型的不同造成的。

本實驗中，皮瓣存活率的對比和血管計數的對比結果不完全一致：皮瓣成活率對照組與其他3組間有統計學差異。不論是皮下注射還是腹腔注射去鐵胺，亦或在二期手術前先進行延遲，其皮瓣存活率均沒有統計學差異；然而，血管計數的結果顯示4組之間兩兩比較都是有差異的，這提示我們，血管計數的結果并不一定能完全反映最終的皮瓣活力與治療效果。此外，我們還發現兩個有趣的現象。首先，經過治療處理的實驗組，不論使用的是去鐵胺還是手術延遲，其微血管的口徑都普遍比對照組粗，也就是說這些干預治療措施都刺激了小血管擴張。其次，手術延遲組的毛細血管數量明顯多于另外2組，大量的細小血管出現在延遲組的組織切片上，推測這是由于延遲主要引起了choke vessel的開放所致?？梢?，雖然低氧模擬劑與手術延遲都能起到相同的促進預構皮瓣血管化的效果，但其作用機理是不同的：延遲主要是通過開放choke vessel，增加側枝血流，重塑皮瓣內部的血流方向來增加皮瓣的血流，同時也存在小血管口徑的增粗；而低氧模擬劑則主要通過刺激小血管口徑增粗來增強皮瓣的血流。這個現象通過低氧模擬劑的信號傳導通路也較容易理解。去鐵胺螯合鐵離子，能夠競爭性地抑制PHD2活性，導致HIF-1α的快速堆積，轉錄活性升高，引起下游的一系列效應分子的表達水平上調和釋放，其中最有代表性的就是VEGF，而VEGF的作用之一就是強烈地擴張小血管平滑肌，增加血管通透性。通過低氧模擬劑的這種作用通路，亦可表明其相對于細胞因子的優越性：細胞因子是單一的下游效應分子，而低氧模擬劑則調控了處于血管化最上游的開關PHD分子，能引起一系列級聯式反應，其作用更加均衡、全面；此外，細胞因子是蛋白制劑，成本高，價格昂貴，還存在過敏反應可能；而去鐵胺是化學藥物，成本低廉，易存貯和運輸，應用安全性相對較高。

4 結論

使用低氧模擬劑去鐵胺，在預構皮瓣一期手術時運用，能顯著提高預構皮瓣的血管化并增強皮瓣活力，其作用相當于在二期皮瓣轉位前進行了一次延遲手術。