小鼠胰腺癌肝轉移模型及相關分子表達的研究

劉玉美 李婷 楊秀疆

胰腺癌惡性程度高、發現晚，晚期常伴有高發的肝轉移而預后不佳，目前在西方國家腫瘤相關死亡中居第4位［1］。為研究胰腺癌的發病及轉移機制、驗證新型化療方案的可行性和有效性，需要進行大量的體內外實驗研究或臨床試驗。其中體內實驗應用相關動物模型模擬人類腫瘤環境，從而進行腫瘤相關研究。建立適宜的胰腺癌動物模型，可以為深入研究胰腺癌的發生發展、侵襲轉移機制以及尋找新的治療策略提供有效的手段。小體積的脾內和胰腺內注射法是自發肝轉移模型的理想選擇，用于研究調控胰腺癌肝轉移的機制。胰腺內注射法屬于原位移植模型，因肝臟轉移瘤形成所需時間長造成荷瘤生存周期長，4 周左右才可形成胰腺原位瘤，培養期間動物的死亡率較高，因而肝轉移成瘤率并不高。1984年，Kozlowski 等［2］首次采用脾臟內移植瘤細胞的方法建立肝轉移模型，該方法具有培養時間短、轉移瘤形成率高、符合血行轉移途徑的優勢，4 周左右即可形成肝臟轉移瘤，很快被用于結腸癌和胃癌等消化系統惡性腫瘤的肝轉移模型研究。根據已有文獻檢索，國內目前罕有經脾注射鼠Panc-2 細胞來建立胰腺癌肝轉移動物模型的報道，本文嘗試建立胰腺癌經脾肝轉移動物模型，為胰腺癌肝轉移生物學行為的研究以及抗腫瘤藥物的篩選提供一個體內實驗環境，并對部分轉移相關分子的基因表達水平的變化進行初步研究，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細胞株 18 只5 周齡，體質量為16～18 g的C57/BL6小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，均置于SPF環境下飼養。鼠胰腺癌Panc-2細胞株（獲贈于日本金沢大學Mukaida Naofumi教授）（Panc-2 源自于胰腺癌導管細胞，能在裸鼠上成瘤，屬于胰腺低分化腺癌，侵襲力較強，容易制造移植和轉移模型）。

1.1.2 主要材料和試劑 RPMI 1640 培養基購自英國Biosera；TRIzol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒購于日本TaKaRa BIO INC；SYBR Premix Ex TaqTM 購于日本TaKaRa BIO INC；PCR 引物購于上海華津生物科技有限公司；美國ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System，等。

1.2 方法

1.2.1 模型建立 本研究獲得復旦大學動物倫理委員會審批，所有實驗動物均按照國家衛生研究所的實驗室動物福利倫理指南進行。選擇處于對數生長期的Panc-2 細胞，以PBS 重懸，配制成瘤細胞懸液，調整細胞濃度為1×107/mL，錐蟲藍染色證實細胞活力在98%以上。腹腔注射麻醉成功后，小鼠取仰臥位，用0.5%的碘伏消毒。取左上腹縱行切口，長1.0 cm左右，進腹顯露脾臟，將其輕輕拖出腹腔外，脾下極進針約1.0 cm，用無齒鑷夾持住脾臟下極的中部（注射針尖略向后方），實驗組12只小鼠分別緩慢注入瘤細胞懸液50 μL（總計5×105個腫瘤細胞），可見脾包膜迅速鼓起、變白。注射結束，待脾臟顏色轉紅，快速拔針，迅速用碘伏棉球壓迫針眼至少5 min，然后將脾臟送回，全層關腹。采用同樣的操作方法，將對照組6 只小鼠注射等量的PBS 緩沖液。術后小鼠常規喂養。待小鼠培養4周時，頸椎脫臼法處死并解剖小鼠，觀察脾臟成瘤情況、腹腔內有無肝臟轉移以及其他部位轉移。取脾臟移植瘤和肝臟轉移瘤組織，行蘇木精-伊紅（H＆E）染色，常規病理學檢查。并留取部分脾臟移植瘤體組織、肝臟轉移灶及其配對癌旁組織放置于-80℃冰箱保存（癌旁組織，通常是指病變部位旁2 cm 之內的組織區域，結合小鼠肝臟體積較小，本文描述的肝轉移灶癌旁組織均取自肝轉移灶旁0.5～1 cm之內的肝組織。）。

1.2.2 轉移相關因子的基因表達水平檢測 首先采用Trizol 法（參考Invitrogen TRIzol 試劑使用說明書）分別提取脾臟移植瘤組織、肝轉移瘤組織以及肝轉移瘤灶旁肝組織總RNA，再進行反轉錄PCR（TaKa-Ra PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒），將獲得的cDNA 進行qRT-PCR，選用SYBR Premix Ex TaqTM 試劑，按照兩步法進行［3-4］。最后使用軟件RQ manager 1.2.1 進行數據分析，得出相關分子的基因在不同組織中的表達fold change值，進行統計學分析。

1.3 統計學方法

用GraphPad Prism 5.0 及SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料采用x±s表示，樣本間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 動物模型構建

實驗組1只小鼠在第4周死亡，尸檢發現該小鼠出現肝臟轉移伴腹膜多發轉移，余11只小鼠活力減弱，遂終止實驗。實驗組12只小鼠中10只出現肝臟轉移瘤，總體的肝臟成瘤率為83.33%，解剖發現：12只小鼠腹腔內均見有較多的血性腹水，脾臟均于注射部位出現單一的種植瘤結節；其中10只肝臟表面及切面見有大小不等的灰黃色病灶，彌散分布，部分融合成塊；此外，除死亡的1只小鼠腹腔內見多發灰白色小結節，余11只小鼠均未見明顯腹膜結節形成。肝臟病灶行病理學檢查，鏡下見部分組織呈實性片狀生長，少數有腺管形成，細胞體積大，核大、深染，異型明顯，可見小核仁，核分裂相多見，間質少，體積較大的病灶中央多可見片狀壞死鈣化灶，壞死區內可見細胞腫脹，細胞核染色質絮狀或邊集、細胞膜及細胞器膜溶解破裂、細胞自溶等細胞壞死現象，符合胰腺導管腺癌的特征。上述實驗結果表明小鼠胰腺癌經脾肝轉移模型成功建立。對照組小鼠活動如常，解剖后觀察脾臟和肝臟紅潤，均未見結節形成（圖1）。

2.2 胰腺癌肝轉移部分轉移相關分子的基因表達水平

采用熒光定量PCR的方法比較脾臟移植瘤灶、肝轉移灶及轉移灶旁的部分與胰腺癌肝轉移相關分子的基因表達水平。在軟件RQ manager 1.2.1中設定分子在肝臟轉移癌旁肝組織的基因表達量為1，則在脾臟移植瘤灶和肝轉移灶中的基因相對表達量均大于1的分子有CCL-17、CCL-22、CD44、CXCL-3、CXCL-5、CXCR2、CXCR7、FGF-2、FGF-7、MMP2、MMP3、MMP9、PDGFα、PDGF-β、PDGFR-α、PDGFR-β、TGF-β1、TGF-β3、UPA、UPAR。除CD44外，其余分子在肝轉移灶和癌旁肝組織中的表達量有顯著差異（P＜0.05），提示這些分子在肝轉移灶的基因表達量高于癌旁正常肝組織，對胰腺癌的肝臟轉移可能發揮促進作用?；蛳鄬Ρ磉_量均小于1 的分子有Ang-2、BAK、BAX、E-cad、HGF、ITGA2、ITGB1、VEGF。這些分子在肝轉移灶與癌旁肝組織中表達量有顯著差異（P＜0.05），提示這些分子在肝轉移灶的基因表達量低于癌旁正常肝組織，對胰腺癌的轉移具有抑制作用。與脾臟癌組織表達量相比，CCL-17、CXCL-5、FGF-2、MMP3在肝臟轉移癌組織表達水平高（P＜0.05），CD44、FGF7、MMP2、Ang-2、E-cad在肝臟轉移癌組織表達水平低（P＜0.05），而CCL-22、CXCL-3、CXCR2、CXCR7、MMP9、PDGF-α、PDGF-β、PDGFRα、PDGFR-β、TGF-β1、TGF-β3、UPA、UPAR、BAK、BAX、HGF、ITGA2、ITGB1、VEGF在兩者中的表達無顯著學差異（P＞0.05，表1，圖2）。

圖1 動物模型構建

表1 不同組織相關轉移分子的基因相對表達情況

表1 不同組織相關轉移分子的基因相對表達情況（續表1）

圖2 不同組織相關轉移分子的基因相對表達量柱形圖

3 討論

癌細胞的侵襲能力是決定癌細胞能夠發生肝轉移的最關鍵因素，有效的接種方法也是影響其能否發生轉移的重要因素之一。通過腫瘤細胞注射法，使用不同的途徑建立胰腺癌肝轉移模型，包括血管內注射法［5］、腹腔內注射法、動脈內注射法、脾內注射法、肝內注射法以及胰腺內注射法。胰腺內注射法或者胰腺內瘤組織移植法均屬于原位移植模型，因小鼠荷瘤生存周期長，培養期間動物的死亡率較高，因而肝轉移成瘤率并不高。脾內注射法具有培養時間短、轉移瘤形成率高、符合腫瘤血行轉移途徑的優勢，4 周左右即可形成有效的肝轉移病灶。因此，本實驗選擇了小體積脾內注射法進行建模。

本實驗采用的小體積脾內注射法由Kopper 等［6］首次提出，最大程度地模擬了人胰腺癌肝轉移過程，是自發肝轉移模型的理想選擇。該方法的常見并發癥是出血和腫瘤細胞滲漏，本實驗構建的小鼠模型均無明顯出血，僅1只小鼠出現腹腔內多發轉移。本實驗中，1只小鼠在第4周出現死亡，解剖發現形成肝臟及腹腔內多發轉移灶，考慮惡性腫瘤本身影響了小鼠的代謝及生長。此外，2只小鼠僅形成脾臟移植瘤，未出現肝臟轉移瘤，考慮與培養周期不夠長、未選擇高轉移胰腺癌細胞系、瘤株活性降低、操作技術誤差以及裸鼠內環境影響和瘤細胞的多潛能分化有關。本研究中肝轉移成瘤率為83.33%，實驗組小鼠數量為12只，仍有待提高，從而進一步驗證該方法的有效性與可靠性。近來有文獻報道［7］采用表達綠色熒光蛋白的胰腺癌細胞進行胰腺尾部注射，構建胰腺癌原位模型，實現了胰腺癌生長及轉移過程非侵入性實時成像，用于研究新型療法對原發灶和轉移灶的治療效果。

在腫瘤診斷時，胰腺癌患者常已出現浸潤周圍組織的局部晚期癌灶，或者遠處轉移［8-9］。腫瘤轉移的發生機制包括腫瘤細胞和宿主微環境之間平衡作用調控的多種連續步驟，胰腺癌肝轉移的步驟，從理論上說包括轉化、增殖、血管生成、侵襲、循環、溢出、肝臟中增殖［10-12］。

在腫瘤的生長、增殖階段，微環境中的許多分子和相應受體結合，引發一系列細胞效應，促進腫瘤細胞的增殖、轉化和遷移。在本實驗中，轉移癌灶中基因相對表達量高于癌旁肝組織的分子PDGF 及其受體PDGFR、FGF-2［13］的過表達或過度活化，BAK、BAX等促凋亡蛋白的低表達［14-16］，共同促進腫瘤生長。TGF-β在腫瘤發生、發展中具有雙重作用：在腫瘤發生的起始階段TGF-β扮演著腫瘤抑制者的角色，而在進展期TGF-β發揮促進腫瘤細胞浸潤轉移的作用［17］。

直徑＜2 mm 的腫瘤可以通過擴散的方式獲得氧和營養，當腫瘤體積增加時，需要建立血管供應［18］，不僅保證了腫瘤擴張的供給，而且為腫瘤細胞提供了血源性傳播的渠道。誘導血管生成的過程受控于腫瘤和宿主細胞產生的促進和抑制血管生成的分子［19］，這些分子包括VEGF［20］、堿性成纖維細胞生長因子［21］、IL-8［22］等，均已被證實在胰腺癌中表達。除此之外，PDGF及其受體PDGFR涉及多種腫瘤的發病機制并在血管生成中起重要作用［23］。本研究結果顯示VEGF、Ang-2在脾臟癌灶、肝臟轉移癌灶中的基因表達水平低于肝轉移灶旁肝組織，但根據文獻報道，VEGF、Ang-2 在前兩者中的基因表達水平高于后者［24］，從而發揮促進腫瘤生長及轉移的作用?？紤]到肝臟組織血供豐富，腫瘤邊緣區血管生成活躍，而腫瘤的中心或內部血管稀疏甚至缺如，胰腺癌本身又是乏血供腫瘤，因此，胰腺癌組織相對肝組織來說，VEGF、Ang-2 的基因相對表達量可能較低，但并不能否認兩者對胰腺癌增殖及侵襲的促進作用。

在腫瘤侵襲、轉移過程中，可能伴隨鈣黏素分子下調，特別是E-cadherin、ITGA2、ITGB-1等黏附分子的表達下降，促使腫瘤細胞間黏附力下降，本實驗結果與之一致［25-26］。腫瘤侵襲過程得益于增強的細胞運動能力、減弱的黏附力以及Ⅳ型膠原蛋白酶、基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9、絲氨酸蛋白酶（t-PA、u-PA）等降解酶的分泌，進展更加有利［27-28］。腫瘤的轉移是一種非隨機的、有組織器官選擇性的高度組織化的過程，已有實驗證實腫瘤細胞的轉移受趨化因子的嚴格調控［29-30］。在本實驗中，CCL-17、CCL-22、CXCL-3等趨化分子的高表達，說明其對腫瘤細胞的轉移促進作用，但具體調控機制尚待進一步研究。

腫瘤細胞形成的栓子可以被毛細血管床捕獲，誘導內皮反應，通過特異的細胞表面受體整合素、鈣黏蛋白和CD44 抗原等，與基底膜上的糖蛋白（如層黏連蛋白）連接［31-32］。緊跟著黏附的過程，腫瘤細胞溢出進入到肝臟實質，肝實質內胰腺腫瘤細胞的增殖受控于生長促進受體和抑制因子的相互作用［33-34］。研究表明［35-36］，HGF-c-met 信號通路參與胰腺癌的浸潤、擴散和轉移，主要通過腫瘤實質與間質的相互作用。但在本實驗中HGF的表達量在癌旁肝組織高于癌組織，其原因可能歸結于肝組織是分泌該生長因子的主要場所。

胰腺癌肝轉移的結果取決于胰腺腫瘤細胞與肝臟環境的相互作用，這些參與其中的分子識別和驗證是證明腫瘤轉移非隨機理論的基礎［37］。本研究利用小鼠胰腺癌肝轉移模型，對相關轉移分子進行初篩，結果與人體胰腺癌轉移相關分子的基因表達水平變化趨勢基本一致，可以作為轉移機制及腫瘤藥物研發的理想模型。但本研究仍然存在一定的局限性：建模數量較少；考慮到納入研究的相關轉移分子數量較多，未進行Western blot、免疫組織化學染色驗證qRT-PCR 結果，未研究因子表達量之間的相關關系；對于部分轉移相關因子的研究僅進行初篩，未對涉及的信號轉導通路進行深入的研究，未來對這些方面可以繼續探索。

綜上所述，經脾小體積注射法成功構建胰腺癌動物模型，為篩選抗腫瘤藥物和研究腫瘤轉移行為提供了有效模型，應用前景較好；胰腺癌的侵襲轉移是復雜的過程，涉及眾多因素。深入揭示和理解胰腺癌侵襲轉移的分子機制，將提供更多的胰腺癌預防和治療的新靶點，有助于制定新的、有效的治療策略，從而有望改善治療效果，提高胰腺癌患者的生存率。