蓮子低聚糖各單體體外益生效果研究

鄭志昌 陳映彤 郭娟娟 徐 暉 鄭寶東 盧 旭

（福建農林大學食品科學學院 福州350002）

以非消化性碳水化合物為底物的糖化發酵和以非消化性蛋白質為底物的致腐性發酵是大腸微生物在上消化道代謝生存的兩種基本方式。有研究表明，益生菌及剩余大腸微生物與非消化性碳水化合物間存在構效關系，并非所有菌株都能等效地利用同一碳源，不同微生物對碳源的利用情況也存在顯著差異，這與菌群之間的糖苷水解酶差異，以及碳水化合物結構特征息息相關[1-4]。非消化性低聚糖以及某些長鏈多糖為膳食益生元，它們通過選擇性促進腸道內有益菌增Px 的活力越高，呈現一定的量效殖，產生短鏈脂肪酸，降低腸道pH 環境或作為腸道細胞的營養物質，對宿主產生有益影響[5-8]。目前，膳食性益生元被認為是除抗生素和益生菌外，有效調節腸道菌群的天然膳食性成分。以酶法轉化或化學方法合成的低聚果糖（FOS）、反式低聚半乳糖（t-GOS）以及抗性淀粉（RS）等膳食纖維的益生功效已被廣泛認可。作為自然界構成和種類最復雜多樣的結構性物質，許多來源于植物或大型真菌的天然碳水化合物普遍被證實具有潛在的益生元功能[9-11]。由于結構新穎，同分異構體廣泛存在，所以純化后不同組分的益生效果的構效關系有待進一步研究確定。

蓮子是中國傳統藥食兩用之佳品，含有豐富的碳水化合物成分，其直鏈淀粉含量高達40%，屬于高直鏈特異性淀粉[12]。此外，還含有其它天然非淀粉類多糖、低聚糖等碳水化合物。蓮子中新發現的新型低聚糖主要包括2 種三糖及1 種四糖，由甘露糖、果糖或葡萄糖通過α-1，6 或α-1，2 糖苷鍵相連，三者能協同促進雙歧桿菌和乳桿菌增殖和產生短鏈脂肪酸，而對于每種低聚糖單體的具體增菌效能未做深入研究[13-15]。益生指數（PI）是比較膳食低聚糖益生效應的定量分析指標之一[16]，可有效評估腸道菌群發酵過程中若干關鍵菌群相對數量的變化情況。本文通過小鼠腸道菌群體外發酵研究，比較3 種蓮子低聚糖（LOS）單體的益生效果差異，為蓮子低聚糖的構效關系研究以及蓮子資源的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子低聚糖單體 （LOS3-1：Man-1→6-Glc-1→2-Fru、LOS3-2：Man-1→6-Man-1→6-Glc，化合物4 為LOS4：Man-1→6-Man-1→6-Glc-1→2-Fru），采用中壓制備型制備色譜法制備，方法參照Lu 等[15]的方法。速凍鮮蓮，綠田（福建）食品有限公司。

低聚果糖，索萊寶科技有限公司；葡萄糖，國藥試劑廠；SPF 級雄性BALB/C 小鼠，上海斯萊克實驗動物有限公司（合格證編號：SCXK（滬）2012-002）；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸標準品，Aladin 試劑（上海）有限公司；選擇性培養基，青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Puri Flash-150 型制備色譜儀，法國Interchim公司；PHS-3C 型精密pH 計，上海精密科學儀器有限公司；7890 型氣相色譜儀，美國Agilent 公司；T6 新世紀紫外-可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；厭氧產氣袋、厭氧培養盒，日本三菱公司；QL-866 型旋渦混勻器，江蘇海門其利貝爾儀器制造有限公司；AL104 型精密分析天平，梅特勒-托利多儀器 （上海） 有限公司；SYQ-DSX-280B 型高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；SPX型生化培養箱，寧波江南儀器廠；恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 試驗培養基

營養肉湯基礎培養基（GAM）：動物組織胃蛋白酶消化物10 g；大豆蛋白胨3 g；酪蛋白胨10 g；消化血清粉13.5 g；酵母浸膏5 g；牛肉膏2.2 g；牛肝粉1.2 g；葡萄糖3 g；KH2PO42.5 g；NaCl 3 g；可溶性淀粉5 g；L-半胱氨酸鹽酸鹽0.3 g；硫基乙酸鈉0.3 g；蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH 7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.4 腸道菌群體外發酵

試驗小鼠飼養于福建醫科大學實驗動物中心（設施使用許可證號：SYXK（閩）2012-0001），取適應期結束后的新鮮小鼠糞便約0.5 g，用20 mL 無菌PBS（0.1 mol/L pH 7.4） 充分混勻作為腸道全菌群模板。以GAM 為基礎培養基，添加5 mg/mL的蓮子低聚糖單體為碳源配制試驗培養基，以添加等量的葡萄糖（Glc）和低聚果糖（FOS）分別作為陰性對照和陽性對照。每組試驗分裝20 mL GAM培養基，各培養基初始pH 值用0.1 mol/L 的無菌NaOH 溶液將培養基調至pH 7.3±0.1，取小鼠新鮮糞便上清液0.5 mL 接入各培養基中，37 ℃氣浴搖床厭氧發酵，于0，6，12，18，24，36 h 分別取樣測定。

1.4.1 發酵液pH 值及菌體密度測定 取特定時間點的發酵液，旋渦混勻器充分混勻5 s 后，以紫外-可見分光光度計檢測OD 值，檢測波長：600 nm。剩余菌液以8 000 r/min 離心5 min 后取上清液，采用精密pH 計測定發酵液pH 值。

1.4.2 發酵液短鏈脂肪酸（SCFAs）含量測定 參考耿梅梅等[17]的方法，略有修改。準確移取2 mL上清液，加入0.5 mL 25%偏磷酸溶液，冰浴處理3 h，再次離心后經0.45 μm 濾膜過濾后進行氣相色譜分析。色譜條件：HP-INNOWAX 色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；起始溫度：100 ℃，保持0.5 min，再以4 ℃/min 的升溫速度加熱至160 ℃，總過程運行16.5 min。進樣量0.2 μL，載氣為氮氣，流速20 mL/min；燃氣氫氣流速30 mL/min，助燃氣空氣流速300 mL/min，尾吹氮氣流量19 mL/min；FID 檢測器溫度240 ℃，進樣口溫度240 ℃；采用不分流的方式。

1.4.3 發酵液NH3含量測定 參考Broderick 等[18]的方法，略有修改。準確移取1 mL 上清液，加入0.5 mL 25%偏磷酸溶液，冰浴靜置30 min。吸取40 μL 樣品溶液于10 mL 試管，依次加入等量去離子水及2.5 mL 苯酚顯色劑，旋渦混勻后，再加入2 mL 次氯酸鹽試劑，混勻后37 ℃水浴10 min，于550 nm 下測定吸光度值。

1.4.4 益生指數 取發酵液100 μL 于15 mL 無菌離心管，用無菌PBS（pH=7.4，0.1 mol/L）溶液稀釋至合適的稀釋度，分別檢測雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、大腸桿菌以及細菌總數，每個稀釋度做3個平行樣。結果以平均值±標準差（±s）表示，單位為：lg CFU/mL。益生指數（PI）的計算公式如下：

PI =（Bif/Toal） -（Bac/Toal） +（Lac/Toal） -（E.Coli/Toal）

式 中，Bif，Bac，Lac，E.Coli，Toal——發 酵 液中特定時間點的雙歧桿菌、擬桿菌、乳桿菌、大腸桿菌以及細菌總數與其在糞便中原始數量的比值。

表1 培養基類型及其培養條件Table 1 The culture medium and conditions of different bacteria

1.5 數據分析

2 結果與分析

2.1 發酵液pH 值變化

腸道菌群發酵液的pH 值與細菌代謝物中的短鏈脂肪酸-無機氮化合物間的比例相關。測定添加不同碳源的小鼠腸道菌群發酵液的pH 值結果如圖1所示。在最初的12 h 內，各組發酵液的pH值均迅速下降，其中以蓮子低聚糖為碳源的發酵液pH 值下降幅度最大，FOS 組次之，而Glc 組的下降幅度最小。12 h 后，FOS 組發酵液的pH 值繼續呈緩慢下降的趨勢，而其余各組則處于波動狀態。

非消化性碳水化合物能夠被雙歧桿菌優先利用，其本質原因在于雙歧桿菌等益生菌的基因組中含有更多與非消化性碳水化合物代謝相關酶類的基因片段[19]。添加蓮子低聚糖單體及FOS 發酵液pH 值下降更加顯著的原因可能在于通過促進益生菌的增殖，增加短鏈脂肪酸產量，同時限制致腐微生物的發酵作用，減少無機氮化合物的生成。而FOS 相比蓮子低聚糖其發酵液pH 下降相對緩慢的原因可能與其聚合度較大，降解速度較慢有關。

2.2 發酵液菌體密度變化

發酵液的菌體密度可定性反映小鼠腸道菌群在不同碳源中生長情況。如圖2所示，以Glc 為碳源的發酵液，菌體密度值上升速度最快，上升持續時間也最長，達到18 h；這與Glc 可作為腸道菌群發酵的共同碳源優先被利用并供菌體生長繁殖有關，進而造成菌體密度提高。在0～12 h 內，以蓮子低聚糖和FOS 為碳源的發酵液菌體密度值沒有顯著性差異（P＞0.05）；LOS3-2、LOS4 及FOS 組的菌體密度在12～24 h 之間呈先下降后上升的趨勢，提示該段時間內發酵液的細菌群落組成可能發生更替。在24～36 h 時期，各組發酵液的OD600值幾乎保持不變，導致菌體密度不再上升的原因可能是體系的營養供應及細菌代謝物積累所致。

圖1 蓮子低聚糖對發酵液pH 值的影響Fig.1 Effect of LOS on pH value of broth

圖2 蓮子低聚糖對發酵液菌體密度的影響Fig.2 Effect of LOS on cell density of broth

2.3 發酵液SCFAs 含量

短鏈脂肪酸也被稱之為揮發性脂肪酸（VFAs），是腸道菌群發酵碳水化合物的最終產物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。通過測定發酵液中主要短鏈脂肪酸的含量，比較不同蓮子低聚糖的產酸量差異。結果如圖3所示。

發酵液中的短鏈脂肪酸以乙酸為主，乙酸和丙酸濃度隨發酵時間延長呈波動上升趨勢，LOS及FOS 均可提高發酵液中的乙酸含量；除LOS3-1 外，LOS3-2，LOS4 以及FOS 對丙酸的產生均沒有明顯的促進作用。發酵液中丁酸和異丁酸含量在6～12 h 內快速上升，隨著發酵時間延長，二者均不斷下降；3 種LOS 均可不同程度地增加丁酸轉化量。

乙酸、丙酸和丁酸是人和其它哺乳動物腸道中豐度最高的3 種短直鏈脂肪酸，約占總短鏈脂肪酸的90%～95%，它們源于腸道菌群對非消化性碳水化合物的發酵作用。而異丁酸與異戊酸等短支鏈脂肪酸通常源于致腐微生物對蛋白質的發酵作用。短直鏈脂肪酸具有塑造腸道環境、作為宿主細胞和腸道微生物的能量，以及參與不同的信號通路等特殊生理效應，短鏈直鏈脂肪酸也因此被認為是益生元發揮健康效應的基礎。在龐大的腸道微生態系統中，不同微生物群體之間存在底物互生與代謝物互生現象[20]，基于這種現象，部分微生物可以在原本無法生長的基質中間接以底物降解物或代謝物作為碳源或能源。有報道指出[21-22]，雙歧桿菌發酵低聚果糖產生的乙酸可被羅氏菌、真桿菌等間接利用。發酵液中的丁酸含量隨發酵時間延長逐漸下降的原因可能是作為能源物質被一些非丁酸產生菌所消耗導致。

圖3 蓮子低聚糖對發酵液中乙酸、丙酸、丁酸和異丁酸含量的影響Fig.3 Effect of LOS on acetic acid，propionic acid，butyric acid and isobutyric acid levels

2.4 發酵液NH3 含量變化

通過測定以蓮子低聚糖為碳源的腸道菌群發酵液中的NH3水平，比較不同蓮子低聚糖對蛋白質發酵作用影響的差異性，結果如圖4所示。在最初的12 h 內，各組發酵液中的NH3含量均迅速增加；12 h 后，以Glc 為碳源的發酵液中的NH3持續緩慢增加，而添加蓮子低聚糖或低聚果糖的發酵液中NH3含量基本保持不變。NH3是一種潛在的有毒代謝產物，源于腸道微生物對蛋白質的發酵作用。添加蓮子低聚糖可顯著降低發酵過程中NH3的產生，說明蓮子低聚糖可抑制腸道微生物對培養基中蛋白質的發酵作用，且不同碳源對蛋白質發酵的抑制作用依次為：LOS4>LOS3-2>LOS3-1>FOS>Glc。

2.5 益生指數

圖4 蓮子低聚糖對發酵液NH3 含量的影響Fig.4 The effect of LOS on ammonia level of broth

通過選擇性培養基定量測定發酵液中特定菌群的數量變化，結果如表2所示。體外發酵12 h后，4 種待測菌群的數量均迅速增加；與Glc 組相比，以LOS3-2 和LOS4 為碳源的發酵液中，雙歧桿菌和乳桿菌數量顯著增加 （P<0.05）；LOS4 和FOS 能顯著減少擬桿菌的數量，FOS 不容易被大腸桿菌所利用。發酵24 h 后，各組培養基的特定菌群數量呈此消彼長的趨勢；與12 h 相比，各培養基的雙歧桿菌、乳桿菌數量基本呈下降趨勢；擬桿菌和大腸桿菌逐漸增加。以LOS3-2、LOS4 及FOS 為碳源的發酵液，雙歧桿菌和乳桿菌數量顯著高于Glc 組，而擬桿菌和大腸桿菌數量則顯著下降（P<0.05）。發酵過程中，各發酵液的細菌總數沒有顯著性差異（P>0.05）。

表2 不同碳源發酵過程中小鼠腸道特定菌群數量的變化（lg CFU/mL，±s）Table 2 Effect of different carbon source on the number of special intestinal flora in mice （lg CFU/mL，±s）

表2 不同碳源發酵過程中小鼠腸道特定菌群數量的變化（lg CFU/mL，±s）Table 2 Effect of different carbon source on the number of special intestinal flora in mice （lg CFU/mL，±s）

注：同列肩標* 表示12 h 時與Glc 組相比差異顯著（P<0.05）；同列肩標# 表示24 h 時與Glc 組相比差異顯著（P<0.05）。

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益生指數是比較膳食益生元益生效果的量化指標，本文以大腸桿菌代替原始公式中的梭狀芽胞桿菌[13]，通過測定小鼠腸道菌群發酵液中特定菌群及其與原始菌群數量的比例變化關系，以雙歧桿菌和乳桿菌為陽性變化值（正值）；擬桿菌和大腸桿菌為陰性變化值（負值），獲得小鼠腸道菌群發酵不同碳源的益生指數，結果如圖5所示。

添加各碳源的培養基接種小鼠腸道菌群12 h 后，各發酵液的益生指數從高到低依次為：LOS4>LOS3-2>FOS>LOS3-1>Glc；其中LOS3-2、LOS4 的益生指數極顯著高于Glc 及LOS3-1 組（P<0.01）。而24 h 各組的益生指數則為：FOS>LOS3-2>LOS4>LOS3-1>Glc，與Glc 組 相 比，LOS3-2、LOS4 及FOS 組的益生指數同樣顯著提高（P<0.05），而3 種蓮子低聚糖之間沒有顯著性差異，且與12 h 相比，各組的益生指數均有不同程度下降。該結果與秦雪梅等[23]研究FOS、低聚半乳糖（GOS）以及聚葡萄糖（POL）對嬰兒腸道菌群的益生作用基本一致。有國外研究者發現，果膠與果膠低聚糖（POS）的益生指數與其甲基化程度及阿拉伯糖含量有關[24-25]，且分子質量相對較小的POS 益生指數高于大分子質量的果膠。由此推測，分子質量相對較低的碳水化合物更適合作為腸道益生菌的發酵底物，從而表現出較高的益生指數。

圖5 小鼠腸道菌群發酵蓮子低聚糖12，24 h 的益生指數Fig.5 The prebiotic index from mouse intestinal flora fermentation of LOS at time 12 h and 24 h

3 結論

本文以3 種不同結構的蓮子低聚糖單體為碳源，通過腸道菌群體外發酵試驗，評價其體外益生效果及其差異，結果表明：蓮子低聚糖體外益生效果良好，不同結構蓮子低聚糖的體外益生效果表現出一定的差異性：

1） 3 種低聚糖均可增加發酵液中的乙酸和丁酸含量，顯著抑制腸道微生物對蛋白質的發酵作用，減少NH3的生成，對碳水化合物/蛋白質發酵平衡產生有利影響。

2） LOS3-2 及LOS4 表現出比LOS3-1 更好的益生效果，二者均可顯著提高12 h 發酵液中的雙歧桿菌和乳酸菌數量，同時降低24 h 的擬桿菌和大腸桿菌數量。

3） 各碳源的益生指數隨發酵時間延長呈下降趨勢，以LOS3-2 及LOS4 為碳源的益生指數在12 h 極顯著高于Glc 及LOS3-1 組 （P<0.01）；LOS3-2 與LOS4 的益生指數在24 h 仍然顯著高于Glc 組，3 種蓮子低聚之間沒有顯著性差異（P>0.05）。