高白鮭肌肉蛋白質組雙向電泳技術體系的優化

于亞文 朱新榮 張 建

（石河子大學食品學院 新疆石河子832000）

蛋白質組（Proteome）于1994年首次提出，定義為“由基因組所表達的全部蛋白質”[1]。近年來，蛋白質組學技術發展迅速，已成為生命科學研究中的重要領域。而雙向電泳 （Two-dimensional electrophoresis，2-DE） 技術是目前蛋白質組研究技術的標準方法[2]。雙向電泳的分辨率較高，近年來，在醫學、農業和微生物學等研究領域廣泛運用[3]。目前，國內對于雙向電泳主要用于分離蛋白質以及后續蛋白質組學的研究。徐永杰等[4]研究了豬肌肉組織雙向電泳分離條件的建立及常見問題；梁光明等[5]研究凡納濱對蝦肌肉蛋白質雙向電泳分離技術的建立；王任等[6]建立大黃魚肌肉組織雙向凝膠電泳方法；丁勤學等[7]就雙向電泳技術中樣品上樣方式及水化上樣等做出討論。目前關于高白鮭的研究，主要集中在營養養殖、貯藏保鮮等方面，基于雙向凝膠電泳技術的高白鮭肌肉組織蛋白尚未見報道。

高白鮭屬鮭科、白鮭屬，為冷水性魚類。營養全面，肌肉蛋白質含量平均為18.83%，氨基酸含量平均為17.48%，其中必需氨基酸含量為9.16%，占氨基酸總量的52.40%[8]，并且肉質鮮美，備受消費者喜愛，具有重要的經濟和營養價值。同時由于其營養價值豐富，水分含量較高，易腐敗變質。如貯藏不當，魚肉的蛋白質、氨基酸等會分解變質，對魚肉品質產生不利影響[9]。本研究以高白鮭為試驗材料，通過對蛋白質樣品的制備方法、上樣量、IPG 膠條的pH 范圍、等電聚焦程序、助凝劑劑量、SDS-PAGE 凝膠濃度及染色方法等因素的比較，優化雙向電泳條件，建立適用于高白鮭肌肉蛋白質的雙向電泳體系，獲得分辨率高、橫紋少等較理想的二維電泳圖譜，為下一步開展高白鮭蛋白質組學的研究奠定基礎，也為其它魚類肌肉蛋白質組學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮮活的高白鮭（1 000±50）g，新疆天潤賽里木湖漁業開發有限公司。真空包裝，于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 試劑與設備

IPG 干膠條 （17 cm）、尿素 （Urea）、硫脲（Thiourea）、二硫蘇糖醇（DTT）、3-[3-（膽酰氨丙基） 二甲氨基]丙磺酸內鹽（CHAPS）、Ampholine（pH 3～10 或pH 5～8）、碘乙酰胺（IAA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、溴酚藍、低熔點瓊脂糖、過硫酸銨（AP）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris 堿、甘氨酸、牛血清白蛋白（BSA）等試劑，北京博奧拓達科技有限公司；其它試劑均使用國產分析純級試劑。

DYY-16D 型 電 泳 儀、WD-9412A 恒 溫 循 環器、DYC-DD2 等電聚焦電泳槽、DYC-SCZ8 垂直電泳槽、DYCX-C 型凝膠成像系統，北京六一生物科技有限公司；臺式冷凍高速離心機、超低溫冰箱，美國Thermo Scientific 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白樣品的制備及定量 液氮研磨法：取高白鮭背脊部肌肉3～5 g，置于液氮中冰凍，研磨后精確稱取0.05 mg 分裝于1.5 mL EP 管中，添加500 μL 的 裂 解 液 （8 mol/L Urea，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，5%Ampholine，0.001%溴酚藍） 裂解2 h，然后在低溫（4 ℃）離心機中12 000 r/min 離心1 h，棄去上層懸浮及下層沉淀，取中間澄清液，即為提取的高白鮭組織蛋白樣品。

丙酮沉淀法：取高白鮭背脊部肌肉2 g，加入6 mL 抽提液（3.00 g Urea，1.55 g 硫脲，15 μL β-巰基乙醇，用0.01 mol 磷酸鹽緩沖液定容至10 mL）勻漿，于4 ℃冰箱放置14 h 后取出，以10 000 r/min，離心20 min，取上清液，向其加入10 倍體積的-20 ℃預冷的丙酮，于-20 ℃冰箱中靜置2 h 后，10 000 r/min，離心10 min，保留沉淀，自然干燥30 min 使丙酮揮發，得到蛋白質團塊。向蛋白質團塊加入500 μL 裂解液，充分打散混勻，4 ℃，10 000 r/min，離心10 min，取上清液備用。

蛋白質定量采用Bradford 法，在波長595 nm條件下，用標準牛血清蛋白繪制標準曲線，對制備蛋白溶液定量，蛋白樣品直接上樣或分裝后于-80℃保持備用。

1.3.2 上樣量選擇方法 17 cm pH 5～8 IPG 膠條上樣量設定3 個對比：60，90，120 μg，進行雙向電泳。

1.3.3 IPG 膠條pH 范圍選擇方法 IPG 膠條設定2 個對比，分別為17 cm pH 5～8 和17 cm pH 3～10，進行雙向電泳。

1.3.4 聚焦時間 一向膠聚焦時間設定2 個對比：程序一，400 V 10 h+1 000 V 2 h；程序二，400 V 16 h+1 000 V 3 h，進行雙向電泳。

1.3.5 平衡時間 膠條平衡時間設定2 個對比：5，15 min，進行雙向電泳。等電聚焦完成后，取出膠條，用濾紙吸取表明多余液體，依次放入平衡緩沖液I （6 mol/L Urea，2%SDS，50 nmol/L pH 8.8 Tris-HCl，20%甘油，1%DTT）、平衡緩沖液II（2.5%碘乙酰胺代替平衡液I 中1%DTT）中，選擇5，15 min 于搖床上平衡。

1.3.6 助凝劑劑量 配制二向膠溶液 （33%水，40%二向凝膠儲備液，25% 1.5 mol/L pH 8.8 Tris堿，1%SDS（10%）混勻，取10 mL 裝入100 mL 小燒杯中，分別加入如表1所示含10%過硫酸銨和TEMED），每隔1 min 檢測二向膠是否凝結，并記錄開始凝膠時間。

1.3.7 二向膠濃度的選擇 二向膠濃度設定2 個對比，分別為10%和12%SDS 聚丙烯酰氨凝膠，配制試劑如表2。

表1 試劑添加量Table 1 Reagents of experiment

表2 不同濃度的凝膠試劑添加量Table 2 Reagents of different concentration in gels

1.3.8 凝膠染色、掃描及圖譜分析 比較分析考馬斯亮藍染色和硝酸銀染色效果。

考馬斯亮藍染色：用考馬斯亮藍染色液（0.12%考馬斯亮藍G-250，40%甲醇，10%冰醋酸）浸泡，搖床上過夜，染色完成后，用蒸餾水清洗2～3 次，再用脫色液（30%甲醇，10%冰醋酸）脫色，每1 h 換新脫色液浸泡脫色，3 次以上，直至圖像清晰為止。

硝酸銀染色：固定，加入固定液（10%冰醋酸，40%無水乙醇蒸餾水定容至500 mL），搖床上過夜，把經固定的膠板置于盛有500 mL 雙蒸水的塑料盤中清洗3 次，每次10 min；致敏，將膠放入致敏液（0.2%硫代硫酸鈉，6.8%乙酸鈉，30%無水乙醇）中，搖床上浸泡30 min，用500 mL 蒸餾水在塑料盤中清洗3 次，每次10 min；染色，加入染色液（0.25%硝酸銀），銀染20 min，振蕩混勻，注意避光，染色完成后，純水洗2 次，每次1 min；顯色，先用少量顯色液（2%碳酸鈉，0.8 mol/L 甲醛溶液）快速洗去“黃褐色泥沙樣”的背景雜質，再加入多量顯色液，快速振蕩，密切觀察染色情況，及時加入終止液（11.6 g/L EDTA），一般2～5 min 即可；終止顯色，在終止液中放置30 min，用蒸餾水搖晃清洗10 min。

脫色后凝膠用Vilber Lourmat 凝膠成像系統掃描并進行圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質樣品制備方法對結果的影響

蛋白質樣品制備是雙向電泳的基礎步驟，是影響結果的關鍵因素[10]。本試驗采用液氮研磨和丙酮沉淀2 種方法進行蛋白質樣品制備。結果顯示利用液氮研磨法提取的蛋白質所得的2-DE 圖譜（圖1a）的蛋白點較少，分辨率低，蛋白質拖尾現象嚴重。丙酮沉淀法是蛋白質組學研究中常用的蛋白質提取方法，可有效對蛋白樣本進行濃縮及除鹽[11]，利用丙酮沉淀法所得的2-DE 圖譜 （圖1b）的蛋白點明顯增多且清晰，拖尾現象減少。丙酮沉淀法有效去除了核酸、脂肪等雜質的影響，提取的蛋白質較純，過夜放置使得蛋白質的提取率增加，所得圖譜效果較佳。因此后續試驗選用丙酮沉淀法進行蛋白質樣品制備。

圖1 不同蛋白質提取方法的2-DE 圖譜Fig.1 The 2-DE map of different protein extraction methods

2.2 不同上樣量的影響

膠條的蛋白上樣量是決定雙向電泳圖譜質量的重要因素之一。本試驗選用17 cm IPG 和考馬斯亮藍染色，對上樣量進行分析。上樣量過高使蛋白質不易分離，易造成圖譜拖尾。而上樣量過低時，低豐度的蛋白質點不易被染色，無法觀察，從而可能丟失很多重要的蛋白質信息。提高蛋白質的上樣量有利于低豐度蛋白質的檢測，而上樣量過高會引起雙向電泳圖譜的畸變，高豐度蛋白會掩蓋其它蛋白點，致使雙向電泳圖譜質量下降[12]。結果顯示當蛋白上樣量為90 μg 時，圖譜（圖2b）蛋白點清晰，縱紋和橫紋較少；上樣量為60 μg時，部分低豐度蛋白沒有被檢測到而使總蛋白點較少；而上樣量為120 μg 時，出現蛋白質點密集分離不開的現象，拖尾嚴重。對比分析可得，17 cm pH 5～8 IPG 膠條蛋白樣品的最佳上樣量為90 μg，所得的圖譜質量較佳。

圖2 不同上樣量的2-DE 圖譜Fig.2 The 2-DE map of different loading quantities

2.3 IPG 膠條pH 范圍對結果的影響

選擇合適的pH 梯度范圍的IPG 膠條對提高雙向電泳圖譜的分辨率很重要[13]。本試驗選取17 cm pH 3～10 和pH 5～8 的IPG 膠條。采用pH 3～10 的IPG 膠條時（圖3a），拖尾現象嚴重，尤其是堿性末端。這可能與高白鮭肌肉蛋白質的種類有關，肌肉蛋白在堿性條件下分離不徹底或含量較高。由于膠條長度一定，pH 范圍越大，分離的蛋白質范圍越廣，而不同pH 值的越難區分，從而導致電泳圖譜出現拖尾現象。pH 5～8 的IPG 膠條（圖3b）的圖譜蛋白點較為清晰，而分離到的蛋白質較少，尤其是堿性蛋白質損失嚴重，圖譜較清晰，縱紋及橫紋少。因此，在選擇IPG 膠條pH 范圍時，要根據試驗目的與研究的蛋白質種類選擇，本研究選用pH 5～8 的IPG 膠條。

2.4 不同聚焦時間對結果的影響

17 cm 的IPG 膠條來說，聚焦時間選擇400 V 16 h+1 000 V 2 h 較為適宜。

合理的等電聚焦程序是獲得高質量及高分辨率圖譜的基礎，等電聚焦程序的選擇直接影響圖譜上的橫紋及蛋白質點的拖尾現象[14]。本試驗采用兩種聚焦時間在其它條件一致的情況下進行雙向電泳試驗。結果顯示，當聚焦時間為400 V 10 h+1 000 V 2 h 時（圖4a），圖譜的蛋白點分布較為集中，并且數量少，由于聚焦時間不足，蛋白質不能很好的在一向膠中分散開。采用聚焦時間為400 V 16 h+1 000 V 2 h 時（圖4b），得到的圖譜蛋白點分散較為均勻，清晰度提高。由此可得，對于

圖3 不同pH IPG 膠條的2-DE 圖譜Fig.3 The 2-DE map of different pH IPG strips

圖4 不同聚焦時間的2-DE 圖譜Fig.4 The 2-DE map of different time of electrophoresis

2.5 不同平衡時間對結果的影響

雙向電泳操作過程中，一向膠中的蛋白轉移到二向膠中需要經過平衡，平衡時間影響蛋白質的轉移程度。膠條平衡過程有利于蛋白從第一向到第二向的轉移，使蛋白質巰烷基化，防止在電泳過程中重新氧化，以確保在此過程中正常遷移。結果顯示，平衡5 min 時（圖5a），蛋白質從一向膠到二向膠的轉移效果較差，在膠片上方出現蛋白質條帶，嚴重拖尾；而平衡15 min 時（圖5b），一向膠中蛋白質較好的轉移到二向膠中，蛋白點較為清晰，橫縱紋較少。膠條的平衡過程是雙向電泳的關鍵步驟，對比分析可知平衡時間選擇15 min 較為合理。

圖5 不同平衡時間的2-DE 圖譜Fig.5 The 2-DE map of different time of balance

2.6 凝膠劑劑量的選擇

雙向電泳操作中，凝膠劑TEMED 和過硫酸銨的用量直接影響膠片凝結時間。凝膠劑劑量的選擇對試驗的成功與否具有重要影響。凝膠劑的劑量過多，膠凝太過迅速，無法將膠灌注到膠板中；凝膠劑用量過少，膠無法按時凝結，膠片脆弱且不光滑，并且長時間等待會影響后續試驗進程。由圖6中可知，隨著TEMED 和過硫酸銨用量的增加，膠凝結的時間明顯縮短，變化顯著。由灌膠所需時間所知，30 min 凝膠時間較為理想，從圖6中可以看出，第5 組凝膠時間復合要求，即添加10%過硫酸銨0.05 mL，TEMED 2 μL。當然，不同溫度也會對凝膠時間有影響，具體選擇時，要根據環境因素以及試驗所合適的凝膠時間選擇。

圖6 不同助凝劑劑量對凝膠時間的影響Fig.6 The influence to time of different concentration of assistant reagent

2.7 不同二向膠濃度的影響

SDS-PAGE 凝膠電泳主要根據蛋白質的相對分子質量進行分離[15]，不同樣品蛋白質的相對分子質量不同，所選擇的凝膠濃度也有差異，因此選擇適宜的膠濃度以達到良好的分離效果。本試驗采用10%和12%兩種膠濃度進行對比，結果發現：高白鮭肌肉蛋白在10%濃度的二向膠圖譜 （圖7a）中分離效果較好，而濃度小的膠在低分子質量蛋白易跑出，并且膠濃度較低膠容易破碎，在操作大膠過程中較困難；而12%濃度的二向膠圖譜（圖7b）的分離效果要差于10%，橫縱條紋相對較多，分離不徹底。因此在后續試驗中第二向選擇濃度為10%的凝膠。

2.8 不同染色方法的影響

染色方法對雙向電泳圖譜分辨率的高低以及蛋白點檢測的靈敏度有很大影響[16]，最常用的檢測方法有銀染和考馬斯亮藍染色兩種，此外還包括放射自顯影和熒光染色等[17]。本試驗用銀染和考染兩種染色方案對高白鮭肌肉組織總蛋白雙向電泳結果進行分析，結果顯示，銀染（圖8a）圖譜中蛋白點多且較為清晰，靈敏度明顯高于考染，而考染（圖8b）圖譜檢測到蛋白點少，靈敏度低。對比分析，銀染靈敏度顯然高于考染，而操作相對復雜，干擾因素較多?？既静僮骱唵?，價格低廉，而蛋白點少且靈敏度低，不易出結果，因此后續研究中，在對比尋找差異蛋白點時可選用銀染法制膠，而結合質譜進行差異蛋白鑒定時選用考染法。

圖7 不同二向膠濃度的2-DE 圖譜Fig.7 The 2-DE map of different concentration in gels

圖8 不同染色方法的2-DE 圖譜Fig.8 The 2-DE map of different staining methods

3 結論

蛋白質樣品的制備是雙向電泳技術最為關鍵的環節，根據樣品自身的特性，選擇最適合的制備方法。肌肉組織由于其特殊性，與其它樣品的雙向電泳略有不同。本研究采用兩種方法進行蛋白質提取，對比電泳結果，丙酮沉淀法能很好的提純蛋白質，該方法去除了核酸、脂肪等雜質的影響，提取的蛋白質較純，使得蛋白質的提取率增加。生物體中大部分蛋白的等電點在pH 4～8 之間，通過對IPG 膠條pH 值選擇的優化試驗，可知線性寬范圍的膠條（pH 3～10）其pH 值分布范圍廣，基本涵蓋樣品中所有等電點的蛋白，而大量蛋白點集中在膠條中間，得到的2-DE 圖譜堿性端拖尾嚴重，蛋白點也較少，總體圖譜質量差，而窄范圍（pH 5～8）的膠條能夠有效提高雙向電泳圖譜的分辨率和靈敏度，然而也會存在pH 梯度外蛋白丟失現象，因此，選擇一個合適pH 梯度范圍的IPG 膠條對提高2-DE 圖譜質量有重要作用。合理的等電聚焦程序是獲得高質量及高分辨率圖譜的基礎，等電聚焦程序的選擇對圖譜上的橫紋及蛋白質點的拖尾直接影響。通過實驗發現一向膠聚焦時間400 V 16 h 比較適宜，蛋白質分散均勻，有效改善圖譜的橫紋及拖尾問題，而選用平衡時間15 min可以使一向膠中的蛋白很好的轉移到二向膠中。在用不同濃度的SDS-PAGE 膠進行第二向電泳時發現，10%的膠中蛋白質圖形點數均勻，效果最佳。最終對比染色方法得到銀染蛋白點多且效果優于考染。

綜上所述，該研究建立的高白鮭肌肉蛋白質雙向電泳體系：丙酮沉淀法制備蛋白質樣品，選用90 μg 上樣量，17 cm pH 5～8 的IPG 膠條，設定一向膠聚焦時間為400 V 16 h+1 000 V 2 h 以及平衡時間為15 min，助凝劑劑量選用過硫酸銨0.05 mL，TEMED 2 μL，采用濃度為10%的二向分離膠以及硝酸銀染色。采用本試驗方法得到的雙向電泳圖譜更為理想，蛋白點清晰，分布均勻，且具有比較好的重復性，這為后續蛋白質組學研究奠定了基礎。