乳頭狀甲狀腺癌中表皮生長因子受體和黏附斑激酶表達及其臨床意義

畢日軍，郗彥鳳

（1.山西醫科大學，山西 太原030001；2.山西省腫瘤醫院病理科，山西 太原030013）

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的組織學類型，占甲狀腺惡性腫瘤的80%，而且近年來發病率呈現快速上升趨勢［1］。一般來說，PTC患者通過手術切除，并結合放射性碘療法，有一個良好預后，5年總生存率大約為95.0%。但是一部分PTC患者初步治療后會出現復發和／或轉移。因此，鑒別PTC患者不良預后有非常重要的意義。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種170 kDa細胞表面糖蛋白。與配體結合后，EGFR激活細胞內MAPK和PI3K／A信號轉導通路，促進增殖、生存、血管生成和遷移等［2］。由受體過度表達、自分泌配體刺激或激活突變導致EGFR信號通路紊亂在一些腫瘤中發揮作用，與以轉移為特征的晚期惡性腫瘤和預后不良相關［3］。黏附斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一種非受體酪氨酸激酶，與癌癥進展有關。在癌細胞中，FAK／Src復合物增加會增強EGFR對MAPK和PI3K的激活，從而增強繁殖、生存、遷移能力和轉移［4］。高水平FAK與人類多種腫瘤侵襲性相關，包括甲狀腺癌［5］。為更好了解EGFR及其下游效應物FAK在甲狀腺癌進展中表達情況，本文在PTC樣本中檢測EGFR和FAK蛋白表達，分析其與臨床病理參數的關系，以及腫瘤轉移擴散過程中EGFR和FAK的變化。

材料和方法

1 臨床資料

收集2016年6月至2018年12月在我院行PTC切除手術的52例患者組織樣本，患者平均年齡為49.8±8.4（39～78）歲。入選標準：①患者手術前未進行任何放化療治療；②經兩位副高以上職稱病理醫師同時診斷；③符合WHO對PTC診斷標準。排除標準：①應用免疫抑制劑治療患者；②有風濕性免疫系統疾??；③合并惡性腫瘤；④癌灶較小不能進行連續切片；⑤排除出血、感染及壞死嚴重者。所有患者或其家屬均簽署知情同意書。醫院倫理委員會審查通過。

2 免疫組化分析

PTC或轉移性淋巴組織樣本經10%多聚甲醛固定，30%蔗糖在4°C脫水。把脫水后的組織放在預冷的鐵片上，OCT包埋。冰凍切片，厚度為10μm，貼片。免疫組化染色用親和素-生物素技術進行。一抗是多克隆兔抗EGFR和FAK（美國Sigma公司），二抗是生物素標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術公司）?？贵w反應后，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察免疫組化染色。

3 免疫組化結果評價

腫瘤切片由兩個對臨床結果一無所知病理科大夫觀察。免疫反應性半定量評價包括強度和分布。染色評分如下：0為無染色；1為弱廣泛分布或腫瘤細胞局部（高達40%）染色；2為中等，腫瘤細胞中超過40%染色；3為強，腫瘤細胞彌漫染色。樣本評分為0和1是低表達，2和3是高表達。典型染色圖片如圖1和圖2所示。

圖1 PTC中EGFR免疫組化表達

圖2 PTC中FAK免疫組化表達

4 統計學處理

實驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗分析EGFR和FAK表達與臨床病理參數相關性。采用Spearman相關性分析評估EGFR和FAK免疫組化染色強度的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PTC中EGFR和FAK蛋白表達水平分析

PTC患者分為兩類：低表達（染色得分0和1）和高表達（染色評分2和3）患者。52例患者中有29例（55.8%）EGFR高表達，有30例（57.7%）FAK高表達。通過Fisher精確檢驗和Spearman相關檢驗證實EGFR和FAK表達顯著正相關（r＝0.805，P＜ 0.001）（表1）。

表1 PTC中EGFR和FAK蛋白表達的相關性分析（n＝52）

2 EGFR與FAK表達與PTC臨床病理參數相關性

我們進一步評估PTC中EGFR和FAK蛋白表達及臨床病理參數相關性（表2和表3）。統計分析顯示，PTC中EGFR和FAK高表達與年齡和性別無相關性。EGFR和FAK高表達與淋巴結轉移、甲狀腺外侵襲和晚期pT顯著相關（P＜0.05）。EGFR和FAK高表達與TNM分期無相關性。EGFR和FAK高表達在不同組織分型PTC中差異有統計學意義（P＜0.001）。

表2 PTC中EGFR蛋白表達與臨床病理參數分析

表3 PTC中FAK蛋白表達與臨床病理參數分析

3 EGFR和FAK共表達與PTC病理參數相關性

下面進一步分析高水平EGFR和FAK共表達與PTC淋巴結轉移和甲狀腺外浸潤相關性（表4）。結果顯示，高水平EGFR和FAK共表達與PTC淋巴結轉移和甲狀腺外浸潤顯著相關。52例PTC患者中，24例患者淋巴結轉移，20例患者甲狀腺外浸潤。24例轉移性PTC中有20例患者高水平EGFR和FAK共表達；20例甲狀腺外浸潤患者中有16例患者高水平EGFR和FAK共表達，陽性率分別為83.3%和80.0%。因此，高水平EGFR和FAK蛋白單獨或共同表達與PTC患者淋巴結轉移和甲狀腺外浸潤顯著相關。

表4 高水平EGFR和FAK共表達與淋巴結轉移和甲狀腺外浸潤相關性

4 原發PTC及相應淋巴結轉移組織中EGFR和FAK免疫組化分析

采用免疫組化分析10例PTC原發腫瘤及相應淋巴結轉移組織EGFR和FAK蛋白表達。與原發PTC相比較，淋巴結轉移組織EGFR和FAK均表現為高表達，其中90%淋巴組織高表達EGFR；80%淋巴組織高表達FAK（表5）。表明EGFR和FAK在PTC淋巴擴散過程中均為高表達。

表5 原發PTC及相應淋巴結轉移組織中EGFR和FAK免疫組化表達情況（n＝10）

討 論

本研究結果證實，原發性PTC及相應轉移淋巴組織中EGFR和FAK共同高水平表達，可能與PTC進展相關。此外，結果也支持EGFR及其下游效應器FAK，在PTC侵襲和轉移中發揮作用。EGFR信號傳導通路參與人類腫瘤細胞進展，在一些人類惡性腫瘤中與侵襲性生物學行為和不良臨床后果有關［6-7］。關于甲狀腺癌，EGFR在未分化甲狀腺癌中上調，與去分化、侵襲性表型和不良預后相關［8］。在PTC中，EGFR高表達與患者不良臨床病理特征，如局部侵襲性和轉移性擴散相關［9］。在甲狀腺癌細胞中，配體與EGFR結合后可激活ERK和AKT通路，促進腫瘤細胞增殖，而且能夠避免程序性細胞死亡，增強遷移及轉移能力。此外，已經證實甲狀腺癌細胞侵襲是由EGFR下游基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）的 激 活 進 行 調 節［10］。EGFR和FAK上述幾項研究提示EGFR、MMPS和FAK之間的功能聯系，可影響惡性細胞遷移及侵襲。

FAK是一種與癌癥進展相關的非受體酪氨酸激酶，可整合生長因子和細胞外信號基質，是整合素依賴的細胞運動及促生長因子中效應分子信號通路的調控因子［11］。在癌細胞中，FAK／SRC復合體增加可激活MAPK和PI3K信號通路，此外EGFR也可激活MAPK和PI3K信號通路，均可增強細胞的增殖、生存和遷移能力［2］。FAK／SRC復合體使酪氨酸磷酸化級聯，從而能夠調節惡性細胞相關信號通路。FAK在甲狀腺癌中高表達，但在非惡性組織中低表達，而且與侵襲性表型相關［12］。體外研究表明，MMPS、FAK與EGFR激活有關，并促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。因此，抑制FAK表達或活性可阻止EGFR調節的侵襲性，并降低人肺腺瘤細胞A549中MMP-9活性，提示FAK通過調節MMP-9促進癌細胞運動［13］。在乳腺癌細胞中，聚甲醛酸通過減少FAK磷酸化和MMP-9表達抑制EGFG誘導的侵襲、遷移和細胞運動能力［14］。同樣，也有報道，EGFR刺激體外甲狀腺惡性細胞中FAK磷酸化和MMP-9表達［15］。抑制EGFR信號通路可抑制MMP-9表達和FAK磷酸化，而FAK反義寡核苷酸處理可抑制MMP-9表達和隨后的細胞侵襲，從而證明它與侵襲直接相關。我們的結果也提示FAK在腫瘤細胞遷移和侵襲中發揮作用。

總之，本研究結果表明，EGFR及其下游效應器FAK蛋白高表達，與PTC淋巴擴散和腫瘤浸潤相關，這表明EGFR和FAK均參與了PTC進展。因而EGFR和FAK兩種分子可能用于預測PTC的侵襲性。此外，評估組織樣本中EGFR和FAK表達可能有助于PTC患者術前的危險分級。