血液分離腸球菌毒力基因及生物膜形成相關性分析

牛冬梅，徐紅靜，周萬青，章金春

（1.南京中醫藥大學第三附屬醫院 南京市中醫院檢驗科，江蘇 南京210001；2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院微生物室，江蘇 南京210008）

腸球菌屬（Enterococcus）是院內感染的重要致病菌，可引起尿路感染、皮膚軟組織感染、腹腔感染、心內膜炎和腦膜炎等，已成為致血流感染第二位的革蘭陽性球菌［1］。腸球菌感染的致病機制復雜，其中毒力基因是主要的原因之一［2］。腸球菌毒力基因及其蛋白物質主要有聚集物質、表面蛋白、透明質酸酶、細胞溶解素、明膠酶、膠原黏附蛋白等，均在其致病中起著重要作用［3］。而細菌生物膜的形成可以阻礙或延遲細菌與抗生素接觸，降低腸球菌對藥物的敏感性，致使感染難以治愈［4］。對于血流感染腸球菌毒力基因及其與生物膜形成的相關研究較少［5］。本文通過對血流感染腸球菌毒力基因分布、生物膜形成能力進行檢測，為了解毒力基因及生物膜形成在腸球菌致病機制作用研究提供依據。

材料和方法

1 菌株來源

收集南京大學醫學院附屬鼓樓醫院2014年至2017年臨床血培養分離非重復腸球菌86株，為使用Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀鑒定到的菌種。包括42株糞腸球菌和44株屎腸球菌。質控菌株為糞腸球菌（ATCC 29212）和金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）均為南京大學醫學院附屬鼓樓醫院微生物室保存的菌株。

2 儀器和試劑

Vitek 2 Compact及配套GP鑒定卡、GP67藥敏卡（法國梅里埃公司）；2×Taq Mix（DBI公司）；PCR引物由上海生工公司合成；PCR擴增儀（PE公司）；瓊脂糖干粉（法國Biowest公司）；100 bp DNA Marker（大連Takara公司）；胰蛋白胨大豆肉湯、胰蛋白胨大豆瓊脂（青島海博生物技術公司）；96孔聚苯乙烯滅菌微孔板（美國Corning公司）；10 g／L結晶紫染液（北京索萊寶科技公司）；電泳儀及GelDoc XR型凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）；Spectra Max M5酶標儀（美國美谷公司）。

3 藥敏試驗

采用紙片擴散法檢測菌株對常規藥物的敏感性，判定標準參照美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2017版的標準［6］。

4 PCR擴增毒力基因

采用加熱煮沸法提取細菌DNA［7］，挑取純培養菌落于內含200 ng／mL蛋白酶K 200μL溶液的1.5mL離心管內，56℃ 水浴2h，后置95℃水浴10min，13000×g離心30s，上清液即為基因檢測模板。采用PCR擴增6種腸球菌毒力基因cyl、esp、asal、hyl、gelE和agg，參照文獻［4-5］合成引物，引物序列見表1。其中cyl、esp、asal、hyl和gelE的反應體系為50μL，包括2×Taq Mix 25μL，DNA模板2μL，cyl、esp、asal、hyl和gelE的上、下游引物（10μmol／L）各1μL，dd H2O 13μL。PCR反應條件：94℃5 min；94℃1 min，56℃1 min，72℃1 min，30個循環；72℃7 min。agg的反應體系為20μL，包括2×Taq Mi×10μL，DNA模板2μL，上、下游引物（10μmol／L）各1μL，dd H2O 6μL。PCR反應條件：94℃5 min；94℃30 s；56℃30 s；72℃1min，30個循環；72℃7 min。PCR產物經12 g／L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結果。

表1 本文所用的引物序列

5 腸球菌生物膜形成試驗

生物膜的體外形成試驗參照文獻［5］進行。將胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）平板上生長過夜的腸球菌用生理鹽水調成3麥氏單位，取10μL菌液加入1mL的TSB肉湯（1∶100稀釋）。取上述稀釋后肉湯200μL加入96孔無菌微孔板中，每株菌3個復孔，以無菌的TSB肉湯作為陰性對照。將微孔板于37℃靜置孵育24h后取出并棄菌液，用生理鹽水沖洗3次，晾干加入100μL 0.5%結晶紫。15min后，用生理鹽水洗至無色。晾干后加入200μL無水乙醇，靜置20min，讀取570nm處的吸光度值（A）。以大于陰性對照A值均數＋3s者判定為生物膜形成陽性。以糞腸球菌ATCC 29212作為質控菌株。

6 統計學處理

采用SPSS17.0進行數據分析，率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 腸球菌藥敏結果

42株糞腸球菌和44株屎腸球菌對不同抗菌藥物顯示出不同的耐藥率，見表2。屎腸球菌對于青霉素、氨芐西林、左旋氧氟沙星耐藥率高于糞腸球菌，差異有統計學意義（P＜0.05）；二者對于萬古霉素、利奈唑胺及高濃度慶大霉素耐藥率差異無統計學意義（P＞0.05），檢出萬古霉素和利奈唑胺耐藥菌株分別為4株和1株。

表2 糞腸球菌和屎腸球菌耐藥率比較

2 腸球菌毒力基因檢測結果

86株腸球菌中cylA、esp、asal、hyl、gelE和agg毒力基因的分布見表3，部分菌株的毒力基因電泳結果見圖1。糞腸球菌攜帶的毒力基因以gelE、asal、cylA、esp和agg為主，未檢出hyl基因；其中僅攜帶gelE基因10株，同時攜帶cyl、esp、asal、gelE和agg基因8株，同時攜帶cyl、esp和asal基因5株，同時攜帶asal和gelE基因4株，同時攜帶cyl、esp、asal和gelE基因3株，僅攜帶asal基因3株，同時攜帶asal、gelE和agg基因2株，同時攜帶esp和gelE基因2株，同時攜帶cyl、asal和gelE基因2株，同時攜帶asa和agg基因1株，未檢出基因2株。屎腸球菌中僅檢出esp和hyl，未檢出其他4種毒力基因。其攜帶基因的組合方式分別為僅檢出esp基因16株、僅檢出hyl基因7株、同時檢出esp和hyl基因9株和未檢出上述6種基因12株。糞腸球菌中gelE、asal、cylA和agg毒力基因的攜帶率均高于屎腸球菌，屎腸球菌中hyl基因檢出率高于糞腸球菌，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 部分菌株毒力基因檢測電泳結果

表3 糞腸球菌和屎腸球菌毒力基因攜帶情況

3 生物膜形成能力分析

血液分離腸球菌生物膜陽性率為32.6%（28／86）。其中42株糞腸球菌中25株能形成生物膜（59.5%），而44株屎腸球菌中有3株能形成生物膜（6.8%）。糞腸球菌的生物膜形成能力高于屎腸球菌（P＜0.05）。

4 腸球菌毒力基因與生物膜形成能力的相關性

42株糞腸球菌和44株屎腸球菌各毒力基因的攜帶情況與生物膜形成能力間均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 糞腸球菌攜帶毒力基因與形成生物膜的相關性

討 論

本文對血流感染腸球菌耐藥性分析發現，血液分離屎腸球菌耐藥率明顯高于糞腸球菌，與全國耐藥監測結果具有一致性［1］。86株血培養腸球菌中檢出萬古霉素耐藥菌株4株（1.16%），檢出利奈唑胺耐藥糞腸球菌1株。萬古霉素或利奈唑胺耐藥菌株的檢出將對臨床有效的抗菌藥物選擇造成極大的挑戰。臨床對于上述藥物的規范使用則是延緩耐藥產生的有效措施。

腸球菌毒力基因及其蛋白物質主要有聚集物質（asal基因編碼一種腸球菌表面結合糖蛋白，能使細菌聚集，增加在宿主細胞的附著能力）、表面蛋白（esp基因編碼腸球菌表面蛋白，是腸球菌表面分子量最大的蛋白質，對感染初期腸球菌的定植和生物膜的形成起重要作用）、透明質酸酶（hyl基因編碼透明質酸酶，協助細菌在組織內擴散）、細胞溶解素（cylA基因與編碼溶細胞素相關，可溶解細胞，加重腸球菌感染的嚴重程度）、明膠酶（gelE基因編碼明膠酶，溶解宿主細胞的膠原蛋白或組織蛋白，使宿主細胞喪失完整性，有利于腸球菌及其致病物質向組織周圍擴散）、膠原黏附蛋白（agg基因）等，均在其致病中起著重要作用［5］。本文結果顯示，血液分離糞腸球菌攜帶的毒力基因以gelE、asal、cylA、esp和agg為主，未檢出hyl基因；屎腸球菌中僅檢出esp和hyl，未檢出其他4種毒力基因。糞腸球菌中gelE、asal、cylA和agg毒力基因的攜帶率均高于屎腸球菌，而屎腸球菌中hyl基因檢出率高于糞腸球菌，差異有統計學意義（P＜0.05）。文獻［5］報道，cylA、asal、gelE為糞腸球菌所特有，hyl為屎腸球菌特有。本文結果與文獻［5，8］報道具有一致性。腸球菌感染的致病機制復雜，單一毒力基因并不能決定其致病性，而是有許多因子參與其致病過程［9］。本文發現血流感染腸球菌攜帶的毒力基因的組合方式有多種。

細菌生物膜在慢性和遷延感染中起著重要的作用。本文發現血流感染腸球菌生物膜形成率為32.6%（28／86），低于文獻［8］報道。其中糞腸球菌形成生物膜的能力（59.5%）顯著高于屎腸球菌（6.8%），這與其他研究結果相一致［9］，但仍低于張肖肖等［8］的研究結果。本文選取的血液分離腸球菌中，毒力基因陽性菌株和陰性菌株均可以形成生物膜，表明腸球菌普遍具有生物膜形成能力［8］。研究報道毒力基因esp、gelE及agg的表達與糞腸球菌生物膜形成密切相關，而esp基因的攜帶與屎腸球菌生物膜形成密切相關［8，10］。亦有研究發現esp基因的表達與生物膜形成能力間無相關性［11］。本研究發現上述毒力基因菌株的生物膜形成能力無相關性，這一差異可能與選取的菌株數量及來源有關，本文選取菌株為血液分離腸球菌。還有待于進一步的驗證。