血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α聯合檢測對早期肝硬化的預后評估價值

胡曉蕾，鄒 儀

（成都市西區醫院消化內科，四川 成都610000）

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損害，主要為肝炎性肝硬化、酒精性肝硬化以及目前已少見的血吸蟲性肝硬化［1］。由于我國是乙肝大國，病毒性肝炎性肝硬化在臨床上最為常見［2］。晚期肝硬化可導致一系列致命的并發癥，如上消化道大出血、肝性腦病、肝癌等［3］。尋找可靠的生物學指標對肝硬化患者的病情進行檢測，可有效預防致命性并發癥的發生，對肝硬化患者預后的提高具有重要意義。前期研究發現，血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α在消化道腫瘤及肝硬化患者中存在異常表達［3-6］，我們推測三者對肝硬化患者的預后評估具有潛在價值。在本研究中，我們比較了血清高lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平組與對應的低水平組的患者的生存率及病情程度，旨在探究聯合血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三項指標對肝硬化的預后評估價值，以期為肝硬化患者的病情監測提供新思路。

材料和方法

1 研究對象

收集2010年1月至2013年1月在我院確診的早期肝硬化患者共330例，年齡36～60歲，平均年齡48.1±12.4歲。研究對象的納入標準如下：①經病理學確診為肝硬化；②Child分級均為A級；③均為首次確診為肝硬化，入院前未經過其他治療。所有研究對象均排除：呼吸系統疾病、惡性腫瘤、心絞痛、心肌梗死等心血管疾病與自身免疫性疾病。Child分級標準參照1972年Pugh修改后的分級標準［7］。由研究人員對研究對象的基本臨床信息如性別、年齡、吸煙史、飲酒史、體質指數（body mass index，BMI）等進行采集。所有納入對象均簽署知情同意書，本研究開展經本院倫理委員會批準。

2 血清學指標的檢測

患者入院次日清晨，由專業醫護人員使用含促凝劑采血管采集空腹外周血10mL。血液標本在1 h內于4℃條件下以12000g離心力離心15min，收集上層血清進行lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α與肝纖維化指標III型前膠原（procollagenⅢ，PCIII）、IV型膠原（collegen type IV，IV-C）、層粘連蛋白（laminin，LN）、透明質酸酶（hyaluronidase，HA）等的檢測。lncRNA MT1JP的檢測方法為實時熒光定量PCR，檢測儀器為Bio-Rad PCR儀V115883，檢測試劑由康維世紀公司提供。實時熒光定量PCR按照SYBR GREEN說明書進行，反應體系為：Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，cDNA 2μL，DEPC水6.4μL。熒光定量PCR循環條件：95°C變性5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45個循環，每組設置3個復孔。使用的引物序列為：lncRNA MT1JP上游引物：5’-AGTGT GTCATAGAGCTTCCTGTTTCATCTCCCAGT-3’下 游引物：5’-TGGAACCAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGC TGCATT-3’；GAPDH上游引物：5’-GGGAGCCAAAA GGGTCAT-3’，下游引物：5’-GAGTCCTTCCACGATA CCAA-3’；采用2-ΔΔCt法計算lncRNA MT1JP的相對表達量，△Ct值＝目的基因Ct值-GAPDH Ct值。CEA的檢測方法為化學發光法，檢測儀器為Architect i2000全自動化學發光免疫分析儀，檢測試劑為專用配套試劑（美國雅培公司）。TNF-α的檢測采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，檢測儀器為SpectraMax iD5多功能酶標儀（深圳邁瑞公司），試劑盒購自美國ADL公司。肝纖維化指標的檢測均采用羅氏C501全自動生化儀，試劑為羅氏原裝試劑。操作過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。以上所有檢測項目質控及標本檢測均嚴格參考儀器及試劑說明書，由本科室專業人員嚴格把控。

3 隨訪

依據患者納入本研究的時間，依次對其進行五年隨訪，統計隨訪期間的死亡人數及對應的死亡時間。隨訪結束后，由專業醫護人員對存活患者進行Child分級，并抽取外周靜脈血進行肝纖維化指標的檢測。檢測過程同上。

4 統計學處理

本研究應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。正態分布數據采用均值±標準差（）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。率的比較采用卡方檢驗。采用Kaplan-Meier法進行生存曲線分析，應用對數秩檢驗（log-rank test）計算生存曲線間的統計學差異。應用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）分析計算三項指標聯合檢測對肝硬化患者五年內存活與否的判別能力，計算曲線下面積（area under the cure，AUC）、靈敏度與特異性。本次實驗的檢驗水準為α＝0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 患者的血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平與基本臨床資料

患者的血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平符合正態分布，三項指標的均值分別為12.77±0.20（-log），8.12±2.08 pg／mL，690.42±93.75μg／L，中位數分別為12.53（-log），8.88pg／mL，693.17μg／L。依據血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平對患者進行分組，各組患者的基本臨床資料見表1。如表所示，患者的年齡、性別、BMI、PCIII、IV-C、LN、HA等基本資料的差異無統計學意義（P＞0.05），可比性良好。

表1 患者的基本臨床資料

2 生存分析

經過五年隨訪，共有34例患者死亡，0例患者失訪。采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗進行生存曲線分析，見圖1。相比高lncRNA MT1JP組，低lncRNA MT1JP組患者的生存時間顯著縮短（χ2＝10.593，P＝0.001，圖1-A）；相比低CEA組，高CEA組患者的生存時間顯著縮短（χ2＝4.792，P＝0.029，圖1-B）；相比低TNF-α組，高TNF-α組患者的生存時間顯著縮短（χ2＝13.113，P＜0.001，圖1-C）。

圖1 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α水平與早期肝硬化患者的生存分析

3 存活患者的肝纖維化指標水平與Child分級

隨訪結束后，296例存活患者的肝纖維化指標水平與Child分級見表2。如表所示，相比于高lncRNA MT1JP、低CEA、低TNF-α水平組，低lncRNA MT1JP、高CEA、高TNF-α水平組患者的PCIII、IV-C、LN、HA水平均顯著升高，Child分級中C級患者所占比例顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 存活患者的肝纖維化指標水平與Child分級

4 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α對肝硬化患者是否生存五年的鑒別診斷

將330例患者分為兩組：五年內存活組與五年內死亡組。如圖2所示，血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α在鑒別肝硬化患者是否生存五年的AUC分別為：0.897（95%CI：0.770～0.960，P＜0.001）、0.813（95%CI：0.712～0.921，P＜0.001）和0.648（95%CI：0.570～0.757，P＝0.002）；在各指標約登指數為最大值時對應的靈敏度及特異性分別為：83.9%／79.6%、76.3%／82.6%和69.1%／58.7%，見圖2-A；聯合血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三項指標在鑒別肝硬化患者是否生存五年的AUC為0.937（95%CI：0.842～0.981，P＜0.001），靈敏度為81.7%，特異性為91.8%，見圖2-B。

圖2 血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α對肝硬化患者是否生存五年的鑒別診斷

討 論

我國是乙肝大國，而肝硬化則是慢性乙肝的主要并發癥之一［8］。早期肝硬化持續發展可導致消化道大出血、肝性腦病、肝癌等并發癥，嚴重威脅患者生命［9］。尋找可靠的指標對早期肝硬化患者的病情進行監測，可為肝硬化的臨床干預提供依據，對其并發癥的預防具有重要意義。

lncRNA MT1JP是一種新發現的lncRNA，可通過調節靶基因轉錄后的水平參與腫瘤的生物學功能，目前已在胃癌、結腸癌等消化道腫瘤中檢測到lncRNA MT1JP低表達，并起著抑癌基因的作用［10］。LIU等［10］應用基因芯片技術對包括肝癌、肺癌、胃癌及結腸癌等76對癌及癌旁消化道腫瘤患者組織中檢測lncRNA MT1JP水平，發現與癌旁組織相比，癌組織中lncRNA MT1JP水平顯著降低。進一步的機制研究，他們還發現抑癌基因p53是lncRNA MT1JP的靶基因，當lncRNA MT1JP下調時，人正常肝細胞L02和肝癌細胞HepG2中p53蛋白水平下降，進而加速細胞惡化和腫瘤形成。肝硬化的重要并發癥即是癌變，而早前的研究也指出，p53參與肝硬化的進程。KOUTB等［11］發現，與對照者相比丙型肝炎性肝硬化患者血漿p53基因顯著下調。綜合上述研究可以推測，lncRNA MT1JP通過正向調控p53，參與肝硬化的發生發展。在本次研究中，我們發現血清低lncRNA MT1JP水平肝硬化患者的生存率顯著降低，而PCIII、IV-C、LN、HA等肝纖維化程度指標的水平及Child分級中C級患者比例均顯著升高，該結論與我們的假設相一致，表明血清高lncRNA MT1JP水平是肝硬化的一種保護因素。CEA是一種廣譜的腫瘤標志物，在消化道腫瘤患者中的表達水平增高［12］。近年來的研究發現，CEA在肝硬化患者體內亦存在異常表達。例如，戚玉海等［13］檢測了38例慢性乙型肝炎與57例肝硬化患者的血清CEA水平，發現CEA在肝硬化失代償期時明顯升高，對判斷肝硬化病情有一定參考意義。在本次研究中，我們發現，相比于低水平組，血清高CEA水平組的肝硬化患者的五年生存率降低，這些研究結果提示，CEA除可用作腫瘤標志物外，還具有用于肝硬化病情監測的潛能。TNF-α是由激活的巨噬細胞產生的能殺死腫瘤細胞的一種活性物質［14］。研究發現，TNF-α對肝硬化的臨床轉歸有一定參考價值。劉德福等［15］對120例肝硬化患者的腹水TNF-α水平進行檢測發現，乙肝肝硬化患者首次腹水中TNF-α水平增高是提示患者預后不良的重要因素，具有重要的臨床預測價值。這一結論在國外研究中也被證實［16］。NAGAI等［16］指出，血清TNF-α水平可用于評估肝硬化患者接受索拉非尼治療的療效評估，且當索拉非尼用量在400 mg／d時患者血清TNF-α下降最為顯著，治療效果也最明顯。在本次研究中，我們發現，血清高TNF-α水平組的肝硬化患者的五年生存率降低，而PCIII、IV-C、LN、HA等肝纖維化程度指標的水平及Child分級中C級患者比例均顯著升高，該研究結果與前期國內外研究相呼應，表明高TNF-α是肝硬化患者不良預后的因素之一。

此外，血清高lncRNA MT1JP與低CEA、低TNF-α水平組肝硬化患者的肝纖維化指標PCIII、IVC、LN、HA在五年內的變化不大，而低lncRNA MT1JP與高CEA、高TNF-α水平組肝硬化患者的肝纖維化指標則顯著增高，且Child分級中C級患者所占比例亦顯著升高，這些結果提示，lncRNA MT1JP可延緩肝纖維化進程，而CEA與TNF-α則可加速肝纖維化化進程，三者有望成為肝纖維化的治療靶標。

綜上所述，本研究探究了血清lncRNA MT1JP、CEA、TNF-α三項指標對早期肝硬化的預后評估價值，有望為肝硬化的臨床診療提供新思路。