半滑舌鰨黏蛋白MUC18基因克隆與序列分析

廉正義，胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒，劉小雪，譚靜

（天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384）

半滑舌鰨Cynoglossus semilaevis是我國名貴的海水魚類之一[1]。隨著工廠化養殖發展，舌鰨皮膚潰爛、腹水癥等病害頻繁發生[2]。研究表明，魚類皮膚黏液主要由黏蛋白、免疫球蛋白、補體、凝集素和溶菌酶等組成[3]。其中，黏蛋白是一種多功能糖蛋白，主要分為膜結合型（即細胞表面黏蛋白）和分泌型兩種類型，已報道大約有20種黏蛋白，在魚類抗感染中具有重要作用[4]。對人和哺乳動物研究表明：黏蛋白與疾病免疫密切相關，已受到國內外學者廣泛關注[5-7]。目前發現膜結合型黏蛋白MUC1、MUC3、MUC13等基因主要在胃腸道黏膜上皮細胞表達，參與細胞信號傳導、黏附、生長及免疫調節[5,7]。Shoe-maker和LaFrentz等[8]報道，魚類運輸脅迫可導致皮膚黏液及黏蛋白減少，引起繼發性細菌感染。迄今為止，在金頭鯛Sparus aurata等魚類中也發現了膜結合型黏蛋白，包括MUC1、MUC13和MUC18等[9]。但是，關于半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆表達研究，目前尚未見有文獻報道[10-12]。

本研究采用PCR方法擴增和克隆了半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因，利用生物信息學方法對預測分析基因蛋白序列的結構域，為進一步研究魚類黏蛋白在抗病免疫應答中的功能提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚

健康半滑舌鰨體質量約為100g，購自天津市某水產養殖公司，經MS-222麻醉后取皮膚組織保存于液氮中備用。

1.1.2 試劑

Trizol試劑、DEPC處理水、焦碳酸二乙酯DEPC試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T Vector購自TaKaRa公司，UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR擴增試劑均購自上海捷瑞生物工程公司，RNA反轉錄試劑盒購自ThermoScientific公司，甲磺酸三卡因MS-222購自北京格林科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的制備

參照薛春雨等[12]，采用Trizol法提取半滑舌鰨皮膚總RNA，按照RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒的操作步驟，將RNA反轉錄為cDNA，-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計與合成

參考半滑舌鰨基因組黏蛋白基因序列（登錄號:XM025055230）設計2對黏蛋白特異性引物用于PCR擴增，引物由金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

1.2.3 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆

以皮膚組織cDNA為模板，采用RT-PCR方法擴增黏蛋白CsMUC18基因序列。PCR擴增體系為25μL，包括cDNA模板2μL、上下游引物各1μL、Master Mix10μL和ddH2O11μL。PCR循環程序為：95℃ 2min，95℃ 45s，56℃或 59℃ 45s，72℃1min，30個循環，72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段；膠回收產物與pMD18-T載體進行連接，進一步轉化到DH5α感受態細胞中，挑取陽性克隆菌液送金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.4 基因序列及其結構分析

參照李雪等[13]描述方法進行，采用ProtParam、TMHMM（https://www.expasy.org/）等在線分析軟件分別預測分析黏蛋白理化性質及結構，MEGA7.0軟件鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因的PCR擴增及理化特性分析

圖1 黏蛋白CsMUC18基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product of the CsMUC18 gene

表1 黏蛋白CsMUC18 PCR擴增的引物序列Tab.1 Primer sequences of the CsMUC18 gene

圖2 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因上下游引物測序圖譜和推導氨基酸序列Fig.2 Sequencing of CsMUC18 gene primers and deduced amino acids

圖3 黏蛋白CsMUC18的信號肽預測圖、跨膜區、抗原指數、蛋白親水性及表面可能性分析Fig.3 Signal peptide,transmembrane domain,antigenic index,prediction of hydrophilicity and surface probability of CsMUC18

采用RT-PCR方法擴增半滑舌鰨皮膚黏蛋白CsMUC18基因片段，分別獲得特異性片段長度大小為1000bp和1200bp左右目的條帶，與預期片段大小一致（圖1），測序獲得長度為870bp和1202bp的兩條序列，經拼接基因全長為1934bp，可編碼635aa，引物序列見圖2。預測該黏蛋白CsMUC18分子量約為69.38kD、等電點為4.90，1個信號肽序列MALRDSACLLLGLLLLCHTWGAWA（1～24aa），包含膜內區（583～635aa）、跨膜區（560～582aa）和膜外區（1～559aa），以及 7 個主要抗原表位區（67～79、172～177、218～225、552～558、593～605、613～618 和628～635aa）（圖 3）。CsMUC18 蛋白修飾位點預測結果顯示：含有8個糖基化位點N-{P}-[ST]-{P}（PS00001）主要有 Asn96/177/247/308/333/393/477/490，主要有 1 個蛋白激酶 CK2磷酸化位點 [ST]-x（2）-[DE]（PS00006）為 Ser156、5 個蛋白激酶 C（PKC）磷酸化位點[ST]-x-[RK]（PS00005）為Ser208/263/496/593/603。

2.2 CsMUC18基因序列比對及進化樹分析

采用Blastp檢索比較黏蛋白基因蛋白序列的同源性，結果顯示CsMUC18與大菱鲆、金頭鯛、斑馬魚和人黏蛋白MUC18相似性分別為61.31%、58.38%、41.09%和32.69%。選取大菱鲆、金頭鯛、斑馬魚和人的黏蛋白MUC18等氨基酸序列進行比對，結果顯示 CsMUC18 在 277～303aa、445～481aa位置存在2個高變區。Motifscan檢索發現：CsMUC18屬于免疫球蛋白家族，其中發現5個免疫球蛋白結構域（25～138、146～247、253～331、342～421 和 428～498aa），依次為免疫球蛋白V-set區（Ig superfamily V-set,pfam07686），免疫球蛋白超家族（Igsuperfamily,cl11960）、類免疫球蛋白（Ig superfamily IG-like,smart 00410）、免疫球蛋白超家族2（Ig superfamily IG-2,pfam13895）、免疫球蛋白 I區（I-set superfamily,cl28434）（圖4）。從NCBI數據庫下載半滑舌鰨、大菱鲆、金頭鯛、斑馬魚、鼠、牛和人等9個物種的黏蛋白構建系統發育進化樹。該進化樹分析顯示：MUC1、MUC13和MUC18等屬于膜結合型黏蛋白，MUC2、MUC5AC和MUC19等屬于分泌型黏蛋白，其中CsMUC18與大菱鲆、金頭鯛和斑馬魚等魚類膜結合型黏蛋白親緣關系最近，自然聚為一支，與人、鼠、牛的黏蛋白親緣關系較近；但是與半滑舌鰨、斑馬魚、人和鼠等物種的分泌型黏蛋白親緣關系相對較遠，聚為另一支（圖5）。

圖4 黏蛋白CsMUC18氨基酸序列比對與結構域預測Fig.4 Multiple alignment and structural domain prediction of deduced amino acid sequence of the CsMUC18

2.3 半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18結構預測

蛋白質二級結構預測表明：黏蛋白CsMUC18以β折疊為主，其中包含1個由α螺旋構成（568～576aa）的跨膜區（圖 6A）；三級結構主要由 6個蛋白亞基組成，其中包括細胞膜外區域由5個免疫球蛋白亞基以及細胞膜內區域1個蛋白亞基組成，與其二級結構預測結果基本一致（圖6B）。

圖5 不同物種黏蛋白與半滑舌鰨CsMUC18氨基酸序列進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of the mucin amino acids sequences in CsMUC18 between semi-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis and different species

3 討論

半滑舌鰨是一種海水底棲魚類，其皮膚、鰓等黏膜組織損傷易導致病原感染[14]。魚類皮膚黏液是阻止病原微生物入侵的第一道防線，其黏膜免疫應答對病原體的防御尤其重要[15]。黏蛋白是黏液的主要成分，分為膜結合型和分泌型兩種類型[4,16]。Adamek等[17]分析了病毒誘導鯉Cyprinus carpio黏蛋白基因在皮膚、鰓和腸道黏膜組織中的表達，表明病毒感染后鰓和腸道黏蛋白基因mRNA表達水平下降，往往造成黏膜組織受損感染加重。Perez-Sanchez等[7]報道，膜結合型黏蛋白MUC18在魚類皮膚和鰓中表達豐富，具有免疫防御、促進機體發育和調節滲透壓平衡等多種功能。研究證實，人黏蛋白MUC18表達水平異常變化與免疫相關疾病發生有關[18,19]。Bai等[20]報道，在人腫瘤組織中黏蛋白MUC18基因表達水平顯著性降低，這與腫瘤細胞增殖擴散有關。研究表明，人呼吸道上皮細胞表面黏蛋白MUC1參與銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa黏附素的黏附結合過程，唾液黏蛋白對口腔及牙齒健康有保護作用，認為在口腔干燥癥和齲病防治有應用前景[21,22]。

迄今，針對魚類皮膚黏蛋白基因克隆表達的研究相對較少[7,11,12]。關于半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆及生物信息學分析，目前未見有報道。Perez-Sanchez等[7]對金頭鯛膜結合型黏蛋白MUC13和MUC18研究表明，MUC18在鰓和皮膚中表達豐富，屬于免疫球蛋白家族基因，含有5個免疫球蛋白結構域。本研究通過生物信息學預測發現，半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18主要包含免疫球蛋白V-set區（Ig superfamily V-set），Ig 超家族（Ig superfamily）、類 Ig（Ig-like）、Ig超家族 2（Ig-2）和免疫球蛋白 I-set區（I-set superfamily）等免疫球蛋白超家族結構域，推測CsMUC18為免疫球蛋白家族基因，這與報道的其他魚類黏蛋白MUC18結果一致[7]。本文選擇黏蛋白MUC1、MUC13和MUC18等22個黏蛋白序列構建系統發育樹，結果顯示半滑舌鰨CsMUC18屬于膜結合型黏蛋白，與大菱鲆、金頭鯛黏蛋白MUC18親緣關系較近，關于MUC18的生理及免疫功能需要進一步研究。

本研究對半滑舌鰨黏蛋白CsMUC18基因克隆及生物信息學分析，預測黏蛋白CsMUC18含有1個信號肽、5個免疫球蛋白結構域及1個跨膜區，為今后深入研究海水魚類黏蛋白的功能奠定基礎。

圖6 黏蛋白CsMUC18的結構預測Fig.6 Structure prediction of CsMUC18