銀鯽的生殖方式

葛彥龍，李池陶，賈志英，石連玉

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

銀鯽Carassius auratus gibelio原指區別于黑鯽和紅鯽的銀色鯽[1]。銀鯽具有2N和3N兩種類型，2N個體具有100條染色體，而3N個體約有156條染色體[2-5]。普通鯽和2N銀鯽都進行正常的減數分裂和兩性生殖，產生各半的雌雄后代，而3N銀鯽生殖方式十分特殊。通常，3N物種不能減數分裂而不育[6]，但銀鯽可以產生不減數卵子[7]（或減數后加倍而不減數），且受精后雌核排除雄核而維持3N倍性[8]。雌核發育的銀鯽本應產生全雌后代，但后代中具有雄性。雌銀鯽遠緣雜交時，進行雌核發育產生5%的雄性，外源雄性基因不起作用，不能解釋雄性的來源；而銀鯽同系繁殖時，產生15%的雄性后代[9]，其偏向雌核發育并含有兩性生殖過程[10]，產生更多的雄性，需要確定銀鯽雌核發育過程如何加入了部分兩種生殖過程。2N鯽和3N銀鯽生活在同一水域，基因組十分相似[11,12]，似乎發生著頻繁的基因交流，需要確定其中的機理。關于銀鯽的生殖細胞發生過程，一般認為銀鯽卵子不減數而進行天然雌核發育，精子減數而可育，但這不符合相同核型細胞減數分裂一致的遺傳原理。本文不再確定銀鯽配子是否發生減數，只通過銀鯽繁殖的后代組成分析其親本和配子倍性的可能性。為敘述方便，本文將2N銀鯽歸為普通鯽，而銀鯽特指3N銀鯽。

1 銀鯽中具有較多含有雄性基因的嵌合體

雌銀鯽用2N鯉Cyprinus carpio精子受精后進行雌核發育，后代基本為雌性，但有一尾雌銀鯽雌核發育后代主要為雄性，即3%的雌性和97%雄性。用雄性特異標記鑒定發現，銀鯽親本和雄性后代都具有雄性標記，而鯉和雌性后代都沒有雄性標記[13]（圖1右）。這表明銀鯽性別主要由基因型決定，少量雌性銀鯽后代不是由性逆轉產生?；蛐头治霰砻?，如果這尾銀鯽親本為由同種體細胞構成的純合體銀鯽，若配子減數，銀鯽親本為XY基因型時[14]，將產生各半的X、Y雌雄配子，雌核發育需要配子加倍產生各半的XX雌性和YY超雄后代；銀鯽親本為YY基因型時，只產生Y雄配子，配子加倍只產生YY超雄后代。若配子不減數，銀鯽親本只能為XXY基因型，雌核發育產生全雄后代。二者產生半數或全部雄性后代，不能形成具有少數雌性的后代組成，因此，這尾雌銀鯽親本只能為嵌合體。雌雄配子不融合且共同發育會產生嵌合體，而極體與雌核共同發育產生的嵌合體不具有雄性基因，這樣，這尾嵌合體銀鯽由雌雄配子不融合產生。若配子減數，X、Y雌雄配子不融合且分別加倍產生XX/YY嵌合體，根據不融合配子分裂啟動的先后能產生0%～100%的雄性后代。若配子不減數，XXX、XXY雌雄配子不融合且不加倍產生XXX/XXY嵌合體，也能產生0%～100%的雄性后代。銀鯽性別主要由基因型決定，含有雄性細胞的嵌合體銀鯽為雄性，極少為雌性。因此，含有雄性細胞的嵌合體雌銀鯽很少見。而嵌合體雄性即便很多，也不容易被發現，因為嵌合體和非嵌合體雄性和雌性銀鯽交配時都主要進行雌核發育，且兩種雄性都可以產生雄配子。雄配子參與生殖時都產生余外的雄性，后代都是產生多數雌性和相對遠緣雜交更多的雄性，不能區分。為了證明雄性嵌合體的存在，可以直接將雄性個體的體細胞分離后用雄性標記鑒定，比如對銀鯽體細胞進行涂片原位雜交或單細胞PCR。也可將雄性逆轉為雌魚，通過其雌核發育的后代組成來分析親本的體細胞組成。將兩條雄性銀鯽逆轉為偽雌魚，同鯉進行雌核發育。用雄性標記進行鑒定，銀鯽親本同雄性后代都具有雄性標記，而鯉和雌性銀鯽后代都沒有雄性標記。后代性別完全由基因型決定，一尾逆轉魚產生了18%的雌性后代和82%的雄性后代[15]（圖1中）。和上文的雌性嵌合體相同，這尾逆轉魚只能為嵌合體銀鯽，因為純合體銀鯽只能產生半數或全部雄性后代。它由配子不融合產生，減數時為XX/YY嵌合體，不減數時為XXX/XXY嵌合體。另一尾逆轉魚產生了48%的雌性后代和52%的雄性后代[15]（圖1左）。雖然可以為同種細胞構成的非嵌合體XY個體，但也同樣適用于嵌合體，只是兩種細胞的比例為1∶1即可。而均等比例嵌合體比不均等比例嵌合體更多。下文介紹的遠緣雜交中使用的雄銀鯽也可以證明為嵌合體。隨機使用的雄性都含有嵌合體，說明雄性中嵌合體的比例很大，不排除純合體雄性的存在。

圖1 銀鯽偽雌魚的雌核發育Fig.1 Gynogenesis of pseudo-female silver crucian carp

2 雄銀鯽的遠緣雜交

遠緣雜交時，雌銀鯽進行雌核發育，N雄核被排除，3N雌核單獨發育而產生大量的后代[16,17]。而雄銀鯽遠緣雜交則十分不同，3N雄核一般不會排除N雌核，雜交也不會產生大量存活的后代。用2N雌鯉同雄銀鯽雜交時，一般情況下，雌核同雄核都解凝并可以融合，但不是簡單的倍性相加，而是倍性相加后排除部分染色體而產生非整倍體。原核融合后紡錘體會發生錯誤，部分染色體遺留在赤道板處而形成非整倍體。二極紡錘體也可能繼而轉變為三極或四極紡錘體而停止分裂。雖然有基本正常的高成胚率，但是胚胎發育到尾部游離前后即死亡[18]。雜交是否可以產生少量存活的個體，需要進一步驗證。用2N雌紅鯽和3N雄銀鯽雜交，也具有正常的成胚率，同樣胚胎發育到尾部游離前后大量死亡。胚胎染色體數從50～142，倍性為1～2.9N[19]。胚胎的最少染色體數為50，為母本的染色體數，說明母本很可能保留了所有的染色體。若雄核為減數的1.5N，那么原核融合的初始倍性為2.5N，染色體丟失后胚胎倍性不可能高于2.5N。因此，筆者認為兩性融合的雄核為不減數的3N，原核融合后胚胎初始倍性為4N，丟失了1.1～3N的雄核染色體，可以產生了1～2.9N的不整倍體胚胎。

這些非整倍體中，如果細胞核恰巧丟失了銀鯽的1個或2個完整倍性的基因組，那就是產生了3N或2N的整倍體雜交鯽，可以存活。其具有鯽的1個倍性和銀鯽2個或1個倍性的基因組。雜交共獲得了2尾青灰色仔魚，他們只能為整倍體且各個倍性基因組完整才能存活，而單倍體或非整倍體的魚均不能成活。完整基因組的整倍體有幾種可能性：雌核發育的2N鯽個體、雄核發育3N銀鯽個體、倍性相加后未丟失染色體的4N雜交個體、倍性相加后丟失1套銀鯽整倍基因組的3N雜交個體和倍性相加后丟失2套銀鯽整倍基因組的2N雜交個體。雌核發育個體表型為母本的紅色，這兩尾青灰色魚只能為其他類型的整倍體魚，但后代數量較少不能統計組成，不能簡單地排除2N雌核發育個體。普通鯽同3N銀鯽雜交實驗與以上結果大致相同，其成胚率較高，大部分胚胎尾部游離前后死亡。但不同的是，其孵化率較高，達到5%[20]，其體型介于鯽和銀鯽之間[21]，基本為雜交魚，但沒有具體數據，需要進一步考證。成活個體可能為倍性相加的4N雜交鯽和去除1套或2套銀鯽整倍基因組的3N或2N雜交鯽。除此之外，成活個體中有5%的個體為父本體型體色的3N銀鯽，為雄核發育產生，雌雄比例為9∶1[20]（圖2）。雄核排除了雌核獨立發育，從雌雄比例推斷父本只能為嵌合體，因為純合體父本雄核發育只能產生半數或全部雄性后代?？傊?，雄銀鯽同2N鯽雜交時，主要產生非整倍體胚胎，不能存活。少量成活個體為整倍的4N或3N和2N兩性生殖后代和少量的3N雄核發育后代，可能產生2N雌核發育后代。如果存在3N和2N雜交后代，就說明2N鯽和3N銀鯽可以相互轉化，使二者基因組保持高度相似性。

3 銀鯽同系或近緣雜交

圖2 雄性銀鯽的遠緣雜交Fig.2 Distant hybridization of male silver crucian carp

兩種近緣3N銀鯽雜交時，可根據體型等特征區分親本。雜交后有9%的受精卵可發育為成魚。這些存活個體具有三種特征：80%的個體為母本特征，15%的個體為介于父本和母本的中間型特征，5%個體為父本特征，其中40%為雄性[22]（圖3右）。80%的母本特征后代為雌核發育產生，基因完全來自雌親本，雄核凝縮而被排除。5%的父本特征的后代為雄核發育產生，基因完全來自雄親本，雌核被排除。15%的中間特征后代基因分別來自父本和母本，基因組貢獻都比較大，才能形成明顯區別父本和母本的后代。這些中間型后代可能為原核融合產生，需要父母本的配子都減數為1.5N，融合后恢復3N倍性。也可以由細胞嵌合產生，父母本的配子都不減數（或減數后加倍而不減數）且不融合可以產生3N嵌合體后代。筆者證明了雄性中具有較多嵌合體，雌性中也應該具有相應比例的嵌合體，只是雌性嵌合體不能用后代性別比例進行鑒別。這些嵌合體只能在兩性生殖中產生，由配子不減數（或減數后加倍而不減數）且不融合產生。這樣就存在配子不減數（或減數后加倍而不減數）且不融合的嵌合途徑，也可能存在配子減數且融合的純合途徑，但不是必要的。雄核發育時雌雄比例為3∶2，不是1∶1，說明雄親本為嵌合體的可能性較大?？傊?，近緣雜交時，親本產生不減數雌雄配子（或減數后加倍而不減數）排除對方配子，分別進行雌核發育和雄核發育?；蛘叽菩鄄粶p數配子（或減數后加倍而不減數）均存活且不融合形成嵌合體個體?？赡墚a生減數配子，在兩性生殖時減數配子融合形成純合后代。3N銀鯽同系繁殖與近緣雜交相同，也應該有相同比例父母本特征的后代，只是這些父母本特征不能通過表型進行分辨，僅可以比較親本和后代之間的基因型來區分。銀鯽同系繁殖也產生80%以上的雌性個體，這說明近緣或同系繁殖產生各種類型后代的比例基本一致，至少雌核發育部分基本一致。此同系繁殖時使用的父本是嵌合體偽雌魚的雌核發育后代[13]，只能為減數時配子加倍形成的YY雄性或不減數時配子直接發育形成的XXY雄性。任何情況下，其兩性生殖后代和雄核發育后代都具有雄性標記，用近緣雜交過程的比例計算，雄性比例為15%加上5%等于20%，實際統計為22%，比例基本一致（圖3左）?？傊?，在銀鯽同系和近緣雜交時，有配子不發生減數的可能性，雌核更容易單獨發育產生多數的雌核發育個體。雄核可以小比例摻入（同雌核不融合）雌核發育中，形成嵌合體。雌核也可以小比例失活，使雄核進行雄核發育，配子減數也可能發生。雌核發育或雄核發育時，減數配子加倍后獨立發育，兩性生殖時減數配子融合發育或加倍后嵌合發育。

圖3 銀鯽的兩性生殖Fig.3 Sexual reproduction of silver crucian carp

4 銀鯽性別的不穩定性

雌銀鯽遠緣雜交時進行雌核發育而保持物種穩定，遠緣雄核無法解凝最終被排除。這種遠緣雌核發育產生的銀鯽后代叫做異育銀鯽[23]。2N鯽和3N銀鯽生活在一起，外形也很難區分。銀鯽主要為雌性，2N雄鯽有更多機會受精雌銀鯽，產生天然的異育銀鯽。這樣，自然界中會存在很多天然的異育銀鯽，自然采集的銀鯽為異育銀鯽的可能性也比較大。異育銀鯽不為雜交魚的形態，均為銀鯽體型，即使生長速度有所差異，但并不影響成年魚的最終體型，均為雌核發育的3N銀鯽。異育銀鯽和銀鯽的基因組相同，沒有本質的區別。雌核發育子代應為全雌后代，而銀鯽遠緣雌核發育時，具有產生全雌后代的情況[24]。但是，更多的情況卻是銀鯽遠緣雌核發育總會產生較小比例的雄性后代。俞豪祥用鯉作父本，對銀鯽進行多代雌核發育繁殖，后代中總有5%的雄性個體[23]。雄銀鯽后代不被使用而被排除，但在后續繁殖時可以不斷產生。用2N鯽作父本，銀鯽也進行雌核發育，后代也會持續產生5%以下的雄性[25]。如果使用麥穗魚Pseudorasbora parva、荷包紅鯉Cyprinus carpio var.wuyuanensis等其他父本，后代也會產生5%以下的雄魚。這說明遠緣雜交時，父本的改變并不會改變銀鯽雌核發育產生少數雄性后代的特點。而雄性不育型銀鯽雄魚精子無效，雌魚只能進行遠緣雜交繁殖，依然可以持續產生小于5%的不育雄性[1]。遠緣雄性基因對銀鯽無效且沒有加入銀鯽基因組的途徑，這說明雌銀鯽可以自發產生5%左右的雄性，與外緣雄性基因無關。一般認為，銀鯽的性別由基因型決定，如果是完全的基因決定，雌魚和鯉父本不具有雄性基因，雄性后代的雄性基因沒有來源。因此，銀鯽的性別為不完全的基因型決定，或者說銀鯽的性別具有5%的不穩定性。如果雌性具有不穩定性，每一代都會有小比例的雌魚逆轉為偽雄魚，偽雄魚不具有雄性基因。筆者將它定義為雌性不穩定性，每一代都十分均等（圖4左）。如果雄性具有不穩定性，就有一定比例的后代逆轉為雌性，以在群體雌核發育中維持雄性基因，筆者將其稱為雄性不穩定（圖4右）。具有雄性基因的偽雌魚，第一代根據是否減數為XXY或XY偽雌魚，將產生全部XXY雄性后代或半數YY超雄后代。從第二代開始，XXY或YY偽雌魚只產生雄性后代。因為銀鯽的性別主要由基因型決定，這些雄性只有少數可以逆轉為偽雌魚。偽雌魚和雌魚共同繁殖時，偽雌魚產生少量的偽雌魚，而雌魚全部產生雌魚。這樣下一代雌魚中偽雌魚的比例很小而很難被使用到，因此，群體繁殖時，雄性不穩定性途徑只能在偶然使用到偽雌魚時產生，并很快消失。而帶有雄性基因的嵌合體銀鯽更可能具有性別不穩定性[26]。但嵌合體銀鯽經過一次雌核發育后會形成純合體銀鯽而終止嵌合體不穩定性途徑。這樣，雌銀鯽遠緣雜交時多代產生小比例雄性現象應該由雌性不穩定性產生，而不是由雄性不穩定性或嵌合體不穩定產生。

5 討論

銀鯽的生殖現象錯綜復雜，充滿矛盾。早期建立的銀鯽繁殖理論只是部分符合事實和遺傳規律，尚需進一步完善。這些指導了銀鯽生殖的研究方向，但也限制了思維，如異精生長效應。蔣一圭等[24,27]用興國紅鯉精子受精方正銀鯽卵子，培育出了生長比銀鯽原種快30%以上的異育銀鯽。但是，雄核被排除，裂解的DNA片段被代謝掉，不能參與遺傳，線粒體遺傳也比較保守，所以，異精效應很難找到遺傳學依據[28]。針對異精效應，沈俊寶作過多年的實驗，用野鯉、鏡鯉雄魚與銀鯽雜交和多次回交，各組合后代完全表現出母本性狀。在相鄰池塘中同銀鯽進行生長對比，各組合后代的生長優勢幾乎相等，沒有發現異精效應[9]。再如，異精雄性效應，蔣一圭認為銀鯽繁殖時，雄魚同銀鯽親緣關系越近，后代雄性比例越高；同鯉雜交，雄性后代為0，同鯽雜交，雄性后代為2.5%，與銀鯽自交為15%[24,29]。這引導人們去尋找其中的遺傳依據。2N鯽可能具有銀鯽雄性基因，受精銀鯽可產生雄性。鯉沒有鯽雄性基因，受精銀鯽不能產生雄性。而雄性后代都具有雄性條帶，這似乎表明2N鯽的雄性基因確實進入到銀鯽后代中并影響了后代性別。但上面的數據并不準確，雌銀鯽同鯉等遠緣雜交時，在一代或多代繁殖中都會產生0%～5%的雄魚[30]。同2N鯽雜交時，也能產生0%～5%雄魚。只有銀鯽自交時雄性比例才會明顯提高。這只能說明3N銀鯽同系繁殖和雌銀鯽遠緣雜交具有不同的生殖途徑，而和親緣關系遠近無關。雄魚具有鯽雄性基因與否，雌魚遠緣雜交都會產生相同比例的雄性，說明銀鯽雌核發育可以自發產生雄性，而不需外緣雄性基因的參與。

再如，銀鯽精子減數分裂和卵子不減數的說法。卵子不減數可以天然雌核發育，而雄性可育是因為精子發生了減數。雌核和后代倍性相同，減數1.5N雄核不能置換或嵌合到不減數3N雌核中，但雄性配子確實加入到后代中而增加雄性比例。桂建芳認為，減數的1.5N雄核和不減數的3N雌核融合成為4.5N合子后排除1.5N染色體以保持3N倍性[31]。這里有兩點不符合遺傳規律。首先，相同的核型應該有相同的減數分裂過程，雌核和雄核都發生減數或者都不發生減數，或者都具有減數和不減數的部分。其次，不均等配子融合后會隨機的丟失染色體，不會排除確定數量的染色體。比如用2N雌鯽同3N雄銀鯽雜交，4N合子會不同程度丟失了染色體，形成不能存活的非整倍體和偶然存活的整倍體后代。因此，產生高比例的兩性生殖后代需要銀鯽雌雄配子為均等配子。卵子和精子同時減數時融合或加倍后嵌合可以產生相同倍性兩性生殖后代，同時不減數時嵌合也可以產生相同倍性的兩性生殖后代。一般認為，卵子沒有發生減數，雌銀鯽遠緣雜交時，會觀察到臨時的3極染色體[32,33]，說明雌核可能為3倍體。雄銀鯽遠緣雜交時，不育的非整倍胚胎中也可以觀察到3極和4極紡錘體[18]，這說明雄核也可能為3N而形成3極以上的紡錘體。這些胚胎中，雄核最多嵌入大于1.5N的92條染色體，也支持雄核不減數。雌核無法大量提取而不能直接證明其是否發生減數，相反，精子減數有了初步的證明。其通過2N、3N鯽精子間或體細胞間染色比對得來[34]。但是，體細胞染色程度比較徹底，而精子致密，內部可能無法染色，這導致結果不夠準確。2N和3N鯽精子因壓縮程度不同，比較體積確定DNA含量也可能不準確[35]。為了解釋3N精子發生減數的結論，出現了3N倍性實際是6n倍性的觀點[36]。6n也可歸為2倍體，但普通的二倍體會產生正常性比的后代，不會出現雌核發育為主的現象，所以銀鯽歸為6n的說法是錯誤的。銀鯽生殖方式的特殊性原因可能是其存在原核不融合過程，導致多數雄核失活的雌核發育和少數雄核存活的嵌合或雄核發育現象。配子是否發生減數沒有確定，2N、3N銀鯽發生遺傳交流的方式也沒有確定。2N鯽和3N銀鯽生活在同一水域，從外觀和基因型都很難區分，說明它們發生著頻繁的遺傳交流，遺傳交流不是通過雌核發育或雄核發育過程，那樣兩個物種基因組沒有融合，還相互獨立。若發生頻繁的基因交流，需要兩種鯽雜交時配子融合且倍性可以單向或雙向轉換。2N鯽自交如果產生不減數配子，受精后會產生3N鯽后代，但染色體數目是150條而不是156條，且2N鯽同系繁殖中沒有發現自然產生3N鯽。3N銀鯽的配子無論是減數的1.5N或不減數的3N，都不能和2N鯽的N配子相加直接形成2N或3N后代。但是，3N雄銀鯽同2N鯽雜交時，3N和N配子融合形成4N合子通過丟失整倍N或2N可間接得到雜合的3N或2N鯽。這樣2N鯽和銀鯽基因組可以整倍融合，類似于兩性生殖，而且倍性可以相互轉換。其他組成的非整倍體胚胎都會死亡，這樣便增加了3N和2N雜合后代的比例，加大了兩種倍性鯽遺傳交流的幾率。這就解釋了兩種鯽為何倍性不同又如此類似。丟失整套染色體說明鯽的基本倍性為N并具有一定的整體性，單倍性為N而不是1.5N。