小麥花粉育性檢測和花粉致死基因攜帶種質的鑒定

(西北農林科技大學農學院，國家楊凌農業生物技術育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部工程研究中心/陜西省作物雜種優勢研究與利用重點實驗室， 陜西 楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國第二大糧食作物，其產量直接影響糧食平衡。因此提高小麥產量，降低小麥生產成本，提高國際競爭力成為我國國民經濟和和社會發展課題中的一項重要內容。在生物界中，雜種優勢是一種普遍現象，利用雜種優勢實現作物的高產育種已在玉米、水稻等作物中取得顯著成果。但是在利用作物雜種優勢研究中發現，2個完全結實正常的品種雜交后，其F1代植株常常表現異常，如葉片壞死、植株黃化甚至枯萎、個體矮小、結實明顯下降等癥狀。Sax[1]在研究小麥雜種的不育性時發現，Bluestem/Amby的正交和反交F1在苗期初期表現正常，當株高達到15～20 cm時植株生長停滯、過度分蘗，隨后死亡。Loegering等[2]和Sears等[3]在普通小麥品種“中國春”和澳大利亞春小麥品種“Timstein”的雜交F1植株上發現，大約有50%花粉敗育。在玉米中，ZmAA1基因被報道為花粉致死基因，編碼了一個α-淀粉酶蛋白，該蛋白屬于家族糖基水解酶，可催化水解多糖分子(1-4)-α-D-糖苷鍵，通過特異干擾花粉中淀粉的正常積累，從而抑制花粉正常發育最終導致花粉發育夭折[4-5]。Chang等[6]在水稻中發現OsNP1的隱性核雄性不育基因。OsNP1編碼假定的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶，該酶調節絨氈層的降解和花粉外壁形成；主要在絨氈層和小孢子中表達。osnp1突變體營養生長正常，但完全不育，并對環境條件不敏感。在小麥中，王鵬等[7]以中國春和澳大利亞春小麥品種的BC1F1代作為定位群體對花粉致死基因Ki進行分子標記定位，并將Ki基因定位于6 B染色體長臂上，但篩選得到的2個遺傳標記距離較遠，其可靠性有待驗證。

本研究試圖通過組配多個雜交組合，鑒定花粉敗育情況，從而證明花粉致死遺傳模式在冬小麥品種中也是一種普遍存在的現象，同時對攜帶花粉致死基因的種質進行鑒定，以期為進一步克隆小麥花粉致死基因奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗所用155個小麥雜交組合F1及其親本，中國春(攜帶顯性花粉致死基因Ki)，寧春4號和寧春16號小麥品種(攜帶隱性花粉致死基因ki[7])均由西北農林科技大學農學院小麥生殖發育與雜優利用課題組提供。

1.2 方 法

1.2.1材料種植

試驗在西北農林科技大學試驗農場進行。2015年4月選取62個小麥品種(系)通過人工去雄、授粉共組配155個雜交組合。 10月將F0種植于試驗地，每個組合種植2行，行長1 m，行距25 cm，株距10 cm。2016年4月在小麥開花期取所有組合成熟花藥用1% KI-I2染色，鑒定花粉育性。2016年11月，將經過鑒定具有半不育花粉育性F1組合的親本以及帶有花粉致死基因的中國春、寧春4號、寧春16號種植于西北農林科技大學小麥中心溫室，通過人工去雄、授粉配制組合，收取F0種子。2017年3月將春化后的F1種植于大田，5月在小麥開花期取成熟花藥用1% KI-I2溶液染色鑒定花粉育性。

1.2.2KI-I2溶液的配制

取2 g KI溶于5～10 mL蒸餾水中，然后加入1 g I2，待全部溶解后，再加蒸餾水定容至300 mL。貯于棕色瓶中備用。

1.2.3小麥花粉育性的檢測

采集小麥成熟花藥置于干凈的載玻片上，然后用鑷子將花藥充分搗碎，使花粉釋放，然后在破碎組織上滴1～2滴1% KI-I2溶液，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸掉多余溶液，隨后置于光學顯微鏡下觀察并拍照。觀察3個穗子(來自不同植株)，每個穗子觀察3朵小花，每片取3個視野。以目測不育花粉粒約占總花粉粒的50%為標準，檢測所有的F1組合。

2 結果與分析

2.1 花粉育性檢測

在小麥開花期，取成熟花藥用KI-I2溶液染色，對可育花粉、不育花粉以及半不育花粉進行鏡檢觀察?？捎ǚ哿Ｈ旧噬钏{色圓形，花粉粒較大(圖1 A)。不育花粉粒較小，不規則，且染不上色(圖1 B)。半不育花粉中，一半的花粉粒呈深藍色圓形，花粉粒較大；另外一半的花粉粒較小，不規則，且染不上色，呈現敗育狀態(圖1 C)。

2.2 小麥雜交組合F1的花粉育性檢測

為了研究Loegering等[2]發現的春小麥花粉致死現象在普通冬小麥中是否也普遍存在，本研究選取了155個F1雜交組合，通過KI-I2溶液觀察成熟花藥。研究表明，大多數F1組合的花粉表現為可育花粉粒狀態，呈深藍色圓形，花粉粒較大。但是有4個F1組合的花粉表現為半不育花粉狀態，一半花粉粒呈深藍色圓形，花粉粒較大；另外一半的花粉粒較小，不規則，染不上色。它們分別是西農9718/鑫農516，西農9817/周麥22，西農9817/西農509，西農261/存麥4號(圖2)。

注：A為西農9817/鑫農516；B為西農9817/周麥22；C為西農9817/西農509；D為西農2611/存麥4號。Bar=0.5 mm。圖2 小麥雜交組合F1花粉活性

注：A為可育花粉；B為敗育花粉；C為半不育花粉。Bar=0.5 mm。圖1 KI-I2染色檢驗花粉活性

2.3 攜帶花粉致死基因品種及雜交組合的鑒定

Loegering等[2]Sears等[3]研究發現，小麥品種“中國春”的6 B染色體長臂上攜帶有顯性花粉致死基因Ki，而澳大利亞春小麥品種“Timstein”攜帶有相應的隱性花粉致死等位基因ki，它們的雜交后代中，F1代出現了50%的花粉敗育現象。王鵬等[7]利用“中國春”和“Timstein”鑒定出在普通春小麥品種寧春4號和寧春16號攜帶有隱性花粉致死等位基因ki。因此本研究以中國春和寧春4號、寧春16號與4個花粉表現均為半不育F1組合的親本分別雜交獲得相應F1，用KI-I2溶液為染料，對其成熟花藥染色鑒定，從而鑒定攜帶花粉致死基因種質；鑒定標準為，對以中國春小麥品種為母本的雜交組合F1植株花粉育性進行檢測，當其花粉不育率為50%時，則證明該組合相應父本品種攜帶等位隱性ki基因；對以寧春4號、寧春16小麥品種為母本的雜交組合F1植株花粉育性進行檢測，當其花粉不育率為50%時，則證明該組合相應父本品種攜帶等位顯性Ki基因。結果(圖3，表1)表明，西農261和西農9817攜帶顯性Ki基因，鑫農516，周麥22，西農509和存麥4號攜帶相應等位隱性ki基因。

注：A為存麥4號；B為西農2611/存麥4號；C為西農2611；D為存麥4號/CS；E為西農2611/寧春4號。Bar=0.5 mm。圖3 攜帶花粉致死基因品種的花粉育性鑒定性

3 討 論

保障糧食安全始終是我國農業科技現階段的重要任務。目前，農作物育種技術中最廣泛應用、最有效的技術之一就是雜交育種技術。雜交水稻、雜交油菜、雜交玉米等對世界糧食起著十分重要的貢獻。雜交小麥的實現和應用，也必將對世界糧食供給起著巨大的作用。目前，已實現商業雜交種生產途徑有細胞質雄性不育(CMS)系為基礎的三系雜交、光溫敏雄性不育(PTGMS)系為基礎的兩系雜交、化學殺雄(CHA)為基礎的兩系雜交、人工去雄為基礎的兩系雜交。盡管以上途徑應用廣泛，但是仍然存在一些固有的問題。CMS系統包括恢復系的種質資源狹窄，生產成本高、CMS系和恢復系之間的遺傳差異較少等問題限制了CMS雜交育種的進一步發展[9]；PTGMS系統種子的繁殖和雜交種子的生產，需要嚴格的環境條件，易受環境變化的影響[10]；CHA系統則不可避免的涉及到環境污染的問題[11]；人工去雄為基礎的兩系雜交，則難以降低種子生產成本。核雄性不育(包括顯性和隱性)在開花植物中是很常見的，但是在雜種優勢利用中一直無法實現，該類型不育系用于商業化生產雜交種子中的主要問題是難以獲得穩定的雄性不育保持系[11]。Driscoll[13]則設想出XYZ體系生產雜種小麥，但未獲成功。1988年，黃壽松等[14-16]首創出附加型藍標小麥核雄性不育，將長穗偃麥草(Agropyronelongatum)4 E染色體附加到小麥核型雄性不育系上(該4 E染色體上攜帶有藍色胚乳基因和育性恢復基因)，從而選育出由藍色胚乳性狀標記的小麥核雄性不育、保持系，簡稱為藍標型(或BM型)小麥雄性不育、保持系。該體系中，淺藍粒種子植株自交結實后粒色分離為深藍、淺藍和白色3種，其中，占3%左右的深藍色籽粒種子長出的植株自交結實，粒色為深藍色，不分離；白色籽粒種子占64%左右，長出的植株全部表現為雄性不育，粒色不分離；而淺藍色籽粒種子占33%左右，長出的植株仍然自交結實，粒色仍然分離為深藍、淺藍和白色3種。這樣白粒種子長出雄性不育植株，可用來配制組合生產雜交種種子；而淺藍粒種子的植株則可以用來進一步繁殖雄性不育系和保持系種子。1998年，李中安[17]創制了易位型藍標小麥核雄性不育，將緊密連鎖的藍色胚乳基因和育性恢復基因易位到“Probus”核雄性不育系4 BS染色體上，雜交種生產原理同附加型藍標小麥核雄性不育。這種雜交種生產體系解決了小麥核基因控制的雄性不育系在生產中難以獲得穩定的保持系，難以獲得大量純合雄性不育系種子的問題。但是，在以淺藍粒作為保持系的自交繁殖群體中，存在3%左右的深藍粒，從而影響了不育系的繁殖效率。據此，王鵬等[7]提出將花粉致死基因ki轉到4 E染色體上，從而藍粒標記基因、雄性可育基因Ms和花粉致死基因ki被緊密連鎖在一起，使4 E單價體無法通過雄配子傳遞，這樣就能徹底解決深藍粒的存在問題。

表1 攜帶花粉致死基因小麥種質鑒定

品種和組合花粉育性攜帶花粉致死基因中國春可育Ki寧春4號可育ki寧春16號可育ki西農261可育Ki西農9817可育Ki存麥4號可育ki鑫農516可育ki周麥22可育ki西農509可育ki中國春/西農261可育中國春/西農9817可育中國春/西純4號半不育中國春/鑫農516半不育中國春/周麥22半不育中國春/西農509半不育西農261/寧春4號半不育西農9817/寧春16號半不育西純4號/寧春16號可育鑫農516/寧春16號可育周麥22/寧春16號可育西農509/寧春16號可育西農9817/寧春16號可育

Loegering等[2]研究發現，“中國春”與澳大利亞春小麥品種“Timstein”雜交后，F1植株花粉不育率為1/2，由此提出小麥花粉致死基因的單基因遺傳模式。Kato等[8]研究認為，小麥品種間雜交F1植株中，花粉不育率不是1/2，而是1/4或1/8，并且由此提出小麥花粉致死性狀是由3個分別命名為Ki2，Ki3和Ki4的互補基因控制的。本研究通過組配155個F1雜交組合，在小麥開花期對成熟花藥用1% KI-I2染色觀察，證明這種花粉致死現象在普通小麥中是廣泛存在的。并且分別以“中國春”、寧春4號、寧春16號春小麥品種為母本的雜交組合，對花粉致死基因做了遺傳模式分析，發現不同組合雜交后，存在花粉異常的F1植株的花粉不育率都為1/2，該結果與之前Loegering和Sears等[2-3]研究結果一致，由此說明花粉致死基因在普通小麥品種中為單基因遺傳模式[7]。

2009年美國先鋒公司利用玉米SPT制種技術，構建了Ms 45-ZmAA1-DsRed 2基因盒的表達載體，對花粉致死基因ZmAA1及啟動子Pg47應用其中。選種時通過光電篩選機利用DsRed紅色熒光挑選種子，可滿足全程機械操作且繁殖時只需隔離自交，成功解決了核雄性不育兩系法運用中的問題[18]。利用花粉致死基因導致攜帶有外源育性基因的雄配子死亡，使轉基因元件不會遺傳給雜交后代，因此有效地解決了受到全球爭議的轉基因食品的安全性問題[19]。與上述技術類似，Chang等[6]利用水稻隱性核不育基因OsNP1與一個α-淀粉酶基因和紅色熒光蛋白(DsRed)基因相結合，構建載體并轉化osnp1突變體，這樣攜帶單合子轉基因水稻自交，可產生1∶1的比例雄性不育種子和轉基因的可育種子，其中轉基因種子可利用DsRed紅色熒光挑選出來，雄性不育種子作為不育系可用來生產雜交種。這樣的新型不育系兼具三系法的穩定性和兩系法配組靈活性的優點，被稱為 “第三代雜交育種技術”(G 3育種技術)[19]。

花粉致死基因在今后作物分子設計不育系技術研究中將起到十分重要的作用，突破作物雜交育種分子設計技術，創制出不受環境限制的、穩定的、具有恢復功能的新型不育系，實現作物雜種優勢利用技術的新變革。