肉蛋白-畜產源非肉蛋白互作的物理化學研究

蔡汝瑩 李凌云 王 鵬,? 吳長玲 徐幸蓮 周 輝

(1南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095;2江蘇雨潤肉類產業集團有限公司,江蘇南京 210041)

凝膠乳化肉制品具有良好的質構特性與口感,是深受消費者喜愛的肉類食品之一。從凝膠乳化肉制品的原料角度看,在較高鹽濃度(＞0.5 mol·L-1NaCl)下肌原纖維蛋白(myofibrillar protein,MP)可以從肉中被提取出來,并發揮油-水乳化作用及熱誘導凝膠作用[1-3]。除了受鹽濃度的影響外,MP 功能性的發揮還受到pH 值、溫度和非肉蛋白等的影響[4-5],其中非肉蛋白包括植物性大豆蛋白和動物性的血漿蛋白、酪蛋白酸鈉(sodium caseinate,SC)等[6-8]。非肉蛋白添加到凝膠乳化體系中主要通過2 種途徑：一是在斬拌過程中加入,以補充水相中蛋白總量;二是利用非肉蛋白與植物油脂進行預乳化,而后將預乳化液部分替代豬背膘從而降低產品總體的飽和脂肪含量[9-10]。前者非肉蛋白起到強化乳化肉糜連續相網絡的作用,后者乳化球膜上的非肉蛋白與連續相肉蛋白相互作用對乳化體系的穩定性有很大影響[7,11]。由此可見,凝膠乳化產品中蛋白質之間的相互作用與乳化肉糜體系穩定、熱誘導凝膠體系形成直接相關。與食品蛋白間互作的研究[12]相比,肉蛋白相關的研究多集中在谷氨酰胺轉氨酶等對肉蛋白體系的交聯增強作用[13-14],或單一非肉蛋白與肉蛋白的互作研究[15],尚缺乏將肉蛋白與多種非肉蛋白置于熱致凝膠模型的系統性探索。從典型非肉蛋白的營養價值和應用現狀角度看,血漿蛋白(porcine plasma protein,PPP)是屠宰后的重要產物。我國屠宰業發達,畜禽血液資源豐富,血液中PPP 蛋白含量高且脂肪含量低,包括人體所必需的全部氨基酸[16],具有良好的營養價值,但因未得到開發而浪費嚴重[17];雞蛋白分離蛋白(egg-white protein isolate,EPI)來源于蛋清,蛋清中含有人體所必需的全部氨基酸,且其氨基酸組成與人體最為接近[18],是良好的蛋白來源;酪蛋白酸鈉(SC)是從動物乳汁中分離出的一種蛋白衍生物,是廉價的優質蛋白源,在食品行業已被廣泛應用[19]。因此,選取PPP、EPI 和SC 3 種優質的非肉蛋白作為本研究的非肉蛋白研究對象,在模擬肉制品加工條件(0.6 mol·L-1NaCl,pH 值6.25)下,利用質構、流變、低場核磁共振等物理化學表征手段,以相互作用指數衡量肉蛋白-非肉蛋白之間的相互作用程度,以期為畜產源非肉蛋白的深度利用、凝膠乳化肉制品的品質調控及新型產品的開發提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

雞胸肉(宰后24 h 以內,0 ～4℃貯藏),購自南京蘇果超市,江蘇省蘇食肉品有限公司生產;豬血漿蛋白(恩彼蛋白NP-2009,粗蛋白含量≥78%),購自寶迪公司;酪蛋白酸鈉(食品級,粗蛋白含量≥82%),購自江蘇博美達生命科學有限公司;雞蛋白分離蛋白(食品級,粗蛋白含量≥81%),購自厚德食品股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Ultra Turrax T25 BASIS 高速勻漿機,德國IKA 公司;Beckman Avanti J-E 高速離心機,美國Beckman Coulter 公司;Physica MCR301 旋轉流變儀,奧地利安東帕公司;HH-3D 水浴鍋,金壇市科析儀器有限公司;TA-XT2i 質構儀,英國Stable Micro Systems 公司;NMI20-025V-Ⅰ核磁共振成像分析儀,蘇州紐邁電子科技有限公司;Diamond 差式掃描熱量儀,珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞胸肉中肌原纖維蛋白的提取 參考Han等[13]的方法,將雞胸肉多余脂肪和結締組織剔除,切碎成小塊后稱重,使用絞肉機絞碎后加入4 倍體積的提取液(SSS,含100 mmol·L-1KCl、20 mmol·L-1K2HPO4/KH2PO4、2 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1EGTA 和1 mmol·L-1NaN3,pH 值7.0,4℃),使用勻漿機高速勻漿30 s,間隔30 s,重復勻漿2 次,然后將所得肉漿用白色紗布過濾后2 000×g 離心10 min,舍棄表層漂浮物和上清液。取上述沉淀,加入4 倍體積混合有1% Triton X-100 的SSS 溶液,然后勻漿30 s(重復均漿2 次)后過濾,再經2 000×g 離心10 min,保留沉淀,重復上述步驟2 ～3 次。取所得沉淀,加入4 倍體積0.1 mmol·L-1KCl,勻漿后于2 000×g 離心10 min,使用相同的KCl 溶液重復上述操作4 次,最終得到純化的MP,于4℃冷庫保存備用。

選取標準的結晶牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)作為標準蛋白質,采用雙縮脲法測定MP 的蛋白質濃度。

1.3.2 樣品制備 單一蛋白液組,即將PPP、EPI 和SC 溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS;含0.6 mol·L-1NaCl、50 mmol·L-1Na2HPO4/NaH2PO4,pH 值6.25),蛋白質濃度為4% (w/w),置于冷庫攪拌過夜,使其充分溶解。將4% (w/w) MP 溶于PBS中,置于4℃冷庫保存備用。復合蛋白液組,即將3 種蛋白液分別與MP 蛋白液按1 ∶1 比例進行混合,且最終體系蛋白濃度為4% (w/w),制備好后置于冷庫備用。

1.3.3 動態流變的測定 采用旋轉流變儀進行樣品的動態流變測試,測試指標包括彈性模量、粘性模量和黏度。

流變：參考Zhao 等[20]的方法并作適當修改。采用50 mm 平板進行測試,將樣品均勻涂布于測試臺,去除樣品中的氣泡,并于20℃下平衡3 min。在樣品與空氣接觸處加液體石蠟密封,防止蛋白液的蒸發。上下狹縫設定為1 mm,角頻率1 Hz,應變為3%,從起始溫度20℃升溫至80℃,升溫速率為2℃·min-1,溫度達到80℃后保溫10 min。測試指標為儲能模量(G′)、損失模量(G″)和相位角(δ)。

黏度值：參考Picotti 等[21]和趙穎穎[22]的方法并作適當修改。將樣品涂布于50 mm 平板上,使其分布均勻并去除氣泡,平衡30 s 后達到測試溫度25℃?？偧羟袝r間為330 s,記錄從0.1 s-1到1 000 s-1剪切速率的黏度值。

1.3.4 差示掃描量熱法的測定 通過差式掃描熱量儀(differential scanning calorimeter,DSC)測定PPP、EPI、SC 和MP 的蛋白質性質。稱量約5 mg 樣品加入坩堝,然后密封完好,取一個空坩堝作為空白對照組。樣品掃描參數：溫度范圍為15 ～95℃,升溫速率為10℃·min-1。通過儀器配帶的軟件進行分析計算蛋白質的最大轉變溫度。

1.3.5 蛋白凝膠的制備 分別取各組蛋白液置于50 mL 離心管中,于2 000×g 條件下離心5 min 以去除氣泡,離心后各取10 g 樣品加入10 mL 燒杯中,每組作3個平行樣品。將樣品進行水浴加熱,從20℃以約2℃·min-1速度線性升溫至80℃,并在80℃保溫10 min,以便形成凝膠,然后將樣品取出并迅速放入冰屑中冷卻,最后于4℃冷庫中放置24 h。

1.3.6 蛋白凝膠質構的測定 參考吳滿剛[23]的方法并略作修改。取出1.3.5 中放在4℃冷庫中的蛋白凝膠,于室溫下靜置30 min 后進行質構測試。質構儀參數為：探頭類型P/5;測前速度2.00 mm·s-1;測試速度0.30 mm·s-1;測后速度2.00 mm·s-1;穿刺距離10.0 mm。蛋白凝膠的穿透力即凝膠強度。

1.3.7 凝膠保水性的測定 參考李慶云[24]的方法。將制備好的蛋白凝膠在0 ～4℃條件下進行離心(10 000×g,10 min),離心后去除液體部分,分別測定離心前后蛋白凝膠質量。按照公式計算凝膠保水性(water holding capacity,WHC)：

式中,M1表示離心后蛋白凝膠的質量;M2表示離心前蛋白凝膠的質量。

1.3.8 自旋-自旋弛豫時間的測定 采用低場NMR弛豫測定蛋白凝膠的橫向弛豫時間(T2)。稱取2 g 蛋白凝膠置于核磁管中進行測試,測試條件為：質子共振頻率為22 MHz,測量溫度為32℃,T2用Carr-Purcell-Mebiboom-Gill(CPMG)序列進行測量,掃描16 次,每次間隔0.299 s,得到10 000 個回波。

1.3.9 蛋白間相互作用指數的計算方法 按照公式計算PPP、EPI、SC 與MP 間相互作用指數[25]：

式中,實際值為各組復合凝膠所測得的儲能模量值或凝膠強度值;理論值為復合凝膠組中各組分蛋白儲能模量或凝膠強度值按濃度比例的加和。

1.3.10 數據統計 運用SAS 統計軟件進行單向方差分析和多重比較,其中方差分析采用ANOVA 法,多重比較采用Duncan 法。

2 結果與分析

2.1 肉蛋白-非肉蛋白相互作用對凝膠黏度的影響

由圖1 可知,PPP、EPI 和SC 3 種單一蛋白液的剪切黏度均較小,其中,SC 在剪切速率小于1.74 s-1時,黏度從-0.008 Pa·s 迅速增長到0.001 Pa·s,呈現顯著的剪切增稠現象,隨后黏度緩慢增長,最終達到0.002 Pa·s,表明在旋轉過程中SC 能夠形成較為緊密的結構,從而不斷增強其抵抗剪切力的能力。隨著剪切速率的增加,PPP 和EPI 黏度分別從0.13、0.02 Pa·s 減小到0.002、0.001 Pa·s。MP 的最初黏度為291.2 Pa·s,在剪切速率小于1.74 s-1時,黏度迅速減小到20.38 Pa·s,隨后緩慢減小直至0.08 Pa·s。

圖1 肉蛋白-非肉蛋白相互作用對蛋白凝膠黏度的影響Fig.1 Effect of interaction between meat and non-meat proteins on the viscosities of protein gels

旋轉過程中,蛋白液間發生相互作用越明顯,其黏度越高。與3 種單一蛋白液相比,含有MP 的蛋白組均表現出相對較高的剪切黏度(P＜0.05);而以MP 為對照組,分別加入3 種蛋白后的黏度與對照組趨勢一致,從初始85.00 ～106.00 Pa·s 的黏度范圍減小至0.041～0.043 Pa·s,均隨著剪切速率的增大逐漸降低。3 種復合溶液剪切變稀的出現,可能是因為旋轉過程中蛋白間發生微弱的絮凝,而隨著剪切速率的不斷增大絮凝結構被破壞,最終出現黏度降低的現象。

2.2 肉蛋白與非肉蛋白流變特性的分析

由圖2 可知,PPP、EPI 和SC 3 種單一蛋白的儲能模量(G′)值顯著低于含有MP 的蛋白組(P＜0.05)。在初始升溫過程,PPP、EPI 和SC 3 種蛋白的G′和損耗模量(G″)均緩慢上升,且其中G″值略低于G′,這與前人的研究結果相似[26-28]。單一蛋白液的相位角(δ)較大且均大于39°,PPP 達到69.88°的最大值,表明此時蛋白液以黏性為主。隨著溫度的不斷升高,G′和G″同時增大,但G′的增幅更大,出現了G′大于G″的現象,說明蛋白液開始向凝膠態轉變,且彈性大于黏性。當升溫至80℃時,PPP、EPI 和SC 的G′分別達到1.93、7.69、0.05 Pa,分別是G″的5.36、7.93 和2.50倍,此時3 種蛋白液的δ 分別為10.55°、7.29°和21.22°;80℃保溫過程中PPP 和EPI 的G′和G″迅速增長,而SC 的G′和G″呈現緩慢增長趨勢;保溫結束后,PPP、EPI 和SC 的G′分別達到44.73、94.80、0.09 Pa,分別達到G″的10.42、13.32 和3.00 倍,表明此時PPP 和EPI 以彈性為主,同時其δ 分別為5.37°和5.00°,也證明了這一點。此外,SC 因受其自身蛋白性質影響,仍以黏性為主,未形成凝膠。

圖2 肉蛋白-非肉蛋白相互作用對蛋白凝膠熱掃描流變的影響Fig.2 Effect of interaction between meat and non-meat proteins on thermal scan rheology properties of protein gels

MP+PPP 組、MP+EPI 組、MP+SC 組的G′始終高于G″。以MP 為對照組,溫度從20℃升至45℃時,MP+PPP 組和MP+EPI 組的G′值有所降低,但變化趨勢與MP 組基本一致;45℃到50℃升溫過程中,MP 組G′急劇上升并達到最大值(285 Pa),表明凝膠化結構開始形成,而MP+PPP 組和MP+EPI 組分別上升至58.70 Pa 和155.00 Pa;50℃到59℃的升溫過程中,MP 組G′迅速降低并達到最低值45.30 Pa,而MP+PPP 組和MP+EPI 組G′持續降低并達到最低值,分別為8.08 Pa 和5.98 Pa;59℃至80℃保溫結束,各試驗組G′均呈持續上升趨勢,且復合蛋白組上升幅度更為顯著,MP 的最終G′達到187.00 Pa,MP+PPP 組和MP+EPI 組分別為182.00 Pa 和166.00 Pa,是PPP 和EPI 單一蛋白液G′的4.07 倍和1.75 倍,表明當MP中分別加入PPP 和EPI 時,兩種蛋白會分別與MP 發生交聯進而未對MP 凝膠性質產生顯著影響(圖2)。

由表1 可知,PPP 與MP 的相互作用指數達到最大值,為57.07%,表明PPP 與MP 間相互作用顯著。EPI 加入后與MP 發生一定相互作用,但相互作用指數低于PPP,為17.81%,表明PPP 和EPI 的添加均對MP 形成的凝膠特性發揮著積極作用,與上述結果一致。此外,因SC 未與MP 發生相互作用,故其相互作用指數為負值。

表1 肉蛋白-非肉蛋白相互作用的儲能模量相互作用指數Table 1 Interaction index of storage modulus between meat and non-meat proteins

DSC 可以測定蛋白質的變性溫度,最大峰值即為蛋白質變性溫度,蛋白質的變性對凝膠的形成具有重要作用。由圖3 可知,各蛋白均出現明顯吸熱峰,其中,PPP、EPI 和MP 含有一個峰值,分別為74.05、72.5 和68.37℃,SC 則出現2 個吸熱峰,第1 個峰值為59.73℃,低于MP 變性溫度, 第2 個峰值為68.82℃。MP 的變性溫度與陳昌等[29]的研究結果基本一致,這一溫度下的變性可能是由于肌球蛋白的輕鏈和尾部的解開造成的。比較各蛋白的DSC 結果與流變結果可知,兩種測定方法所得的蛋白變性溫度基本一致;各單一蛋白變性溫度與各蛋白復合MP 后溶膠的變性溫度相比,PPP、EPI 和SC 的復合MP 溶膠的變性溫度均發生位移,分別位移至74、77 和80℃保溫階段。

2.3 肉蛋白-非肉蛋白相互作用對蛋白凝膠強度的影響

凝膠強度是一種重要的凝膠性質,對重組肉制品品質有重要影響[30]。由2.2 可知,SC 加熱后不能單獨形成凝膠,因此未對SC 進行質構測定。由圖4 可知,EPI 的凝膠強度達到22.20 g,顯著高于PPP(8.40 g)和MP(10.63 g)(P＜0.05)。以MP 為對照組,當在MP 中加入PPP 時,其凝膠強度分別為11.30 g,與對照組無明顯差異;當加入EPI 時,其凝膠強度為20.77 g,與對照組相比存在顯著差異(P＜0.05);當加入SC后,其凝膠強度顯著下降(P＜0.05)。

由表2 可知,EPI 與MP 的相互作用指數最大,為26. 57%,表明EPI 與MP 間相互作用最為顯著。PPP 加入后也與MP 發生一定相互作用,但相互作用指數低于EPI,為18. 70%,說明PPP 和EPI 的添加均對MP 形成的凝膠的凝膠強度發揮積極作用。SC 未與MP 發生相互作用,因此其相互作用指數為負值。綜上,當加入PPP 后,PPP 與MP 相互作用,但在減少MP 含量的同時其凝膠強度未發生明顯變化;EPI 與MP 相互作用后可明顯提高MP 的凝膠強度。

表2 肉蛋白-非肉蛋白相互作用的凝膠強度相互作用指數Table 2 Interaction index of gel strength between meat and non-meat proteins

2.4 肉蛋白-非肉蛋白相互作用對凝膠保水性的影響

圖3 肉蛋白與非肉蛋白的DSC 變化曲線Fig.3 DSC curves of meat protein and non-meat proteins

由圖5 可知,PPP、EPI 及MP+PPP、MP+EPI 的凝膠保水性均顯著高于MP(P＜0.05)。分別加入PPP和EPI 后,MP 凝膠的保水性從70.36%分別增加到83.40%和82.30%,表明添加PPP 和EPI 可以顯著增強MP 凝膠保水性(P＜0.05)。但添加SC 后MP 凝膠的保水性降低至66.26%,說明添加SC 會顯著降低MP 凝膠保水性(P＜0.05)。

圖5 肉蛋白-非肉蛋白相互作用對蛋白凝膠保水性的影響Fig.5 Effect of interaction between meat and non-meat proteins on water holding capacity of protein gels

2.5 蛋白凝膠NMR 弛豫時間及水的分布狀態

NMR 弛豫時間(T2)可以反映蛋白凝膠中的水環境,T2越大說明水分子所受的束縛越小。由圖6 可知,蛋白凝膠在0.1 ～10 000 ms 弛豫時間內分布有3個峰,分別對應水的3 種不同形態,其中第1 個峰為凝膠中的結合水(T21),第2 個峰為凝膠中的不易流動水(T22),第3 個峰為凝膠中的自由水(T23)[31]。在1 ～5 ms 出現T21小峰,150 ～820 ms 出現T22小峰,1 800 ～6 200 ms 出現T23小峰。PPP 和EPI 的T21分別出現在1～4 ms 和1.5～3 ms,T22分別出現在117 ～357 ms 和166～581 ms,PPP 未出現T23峰,EPI 凝膠的T23峰出現在2 866～7 575 ms。SC 與MP 復合凝膠的T22弛豫時間最長,出現在31～1 336 ms。

各狀態水所占的百分含量為各峰與橫坐標面積的百分比,分別記為P21、P22、P23(表3)。與MP 相比,PPP 和EPI 的P21和P23均顯著減小(P＜0.05),P22比例顯著增大(P＜0.05)。當在MP 中分別加入PPP 和EPI 后,其P22對應的峰均顯著增大(P ＜0.05),P23對應的峰均顯著減小(P＜0.05),說明添加PPP 和EPI 后MP 的水分流動性降低。加入SC后,其P22對應的峰顯著減小(P＜0.05),P23對應的峰顯著增大(P＜0.05),說明SC 添加后MP 凝膠的水分流動性增大。

圖6 蛋白熱誘導凝膠水分的弛豫時間Fig.6 Relaxation time(T2) of water in protein gels

表3 蛋白熱誘導凝膠水分子分布狀態Table 3 States of water molecular of heat-induced protein gelation/%

3 討論

根據蛋白質間構象的差異程度及介質的物理化學條件,不同蛋白相互作用后可能形成不規則凝聚物、凝膠或者纖維狀產物等[12]。本研究通過使用流變儀表征了不同蛋白單獨及混合后的熱掃描粘彈性變化,MP的單獨流變結果與前人研究[20,32]基本一致。本試驗結果表明,當在MP 中加入SC 后,SC+MP 組儲能模量始終低于MP 組,表明SC 的添加會對MP 成膠性產生不利影響,阻礙了蛋白與蛋白間的相互作用。由DSC和流變結果可知,PPP 和EPI 的變性溫度高于MP,而SC 的變性溫度低于MP 的變性溫度,將3 種非肉蛋白分別加入MP 后,隨著加熱的進行,PPP、EPI 與MP 間疏水基團不斷暴露,促進了二硫鍵的形成。由于巰基和二硫鍵的存在,蛋白間不斷發生相互作用直至MP變性完成,增強了蛋白分子間的結構,有利于提高蛋白的凝膠強度;而SC 在MP 達到變性溫度前,已有部分結構發生變性,阻礙了蛋白間的相互作用。同時SC是酪蛋白經過堿處理的產物,堿處理雖然增加了產品的溶解度及乳化性,但使得其熱凝膠性質喪失,因此,SC 僅以吸附和填充狀態形成凝膠,未發生自身或者與MP 相互交聯。PPP 和EPI 均可自身成膠且具有良好的凝膠強度。羊血漿蛋白-羊肉MP 復合凝膠的研究結果表明,疏水相互作用、二硫鍵是二者之間的主要作用力[15]。PPP 和EPI 在加熱過程中與MP 可能發生交聯作用,進而形成了與單一MP 凝膠相似的流變結果。本研究中,PPP 和EPI 的儲能模量和凝膠強度的作用指數均大于0,而SC 與MP 的相互作用指數均小于0,表明PPP 和EPI 均與MP 發生良好的相互作用,發生了非肉蛋白-肉蛋白間的正向相互作用。

保水性是凝膠的一個重要性質。研究表明,血液自身在加熱條件下可形成凝膠從而保持住水分,其中起到交聯作用的主要是PPP[33]。EPI 在加熱后形成的緊密聚集體對保持水分起著重要的作用[34]。自由水是蛋白凝膠中的最易流動水,同時也是在離心過程中最易除去的水分,這部分水分的相對含量越高意味著蛋白凝膠的保水性越差。本試驗中,添加SC 后的MP 凝膠具有最大的P23,說明MP+SC 凝膠保水性最弱,且加入PPP 和EPI 后顯著增加了P22對應的峰面積,同時P23均顯著減小,說明PPP 與EPI 通過促進自由水向不易流動水的轉化,提高了MP 凝膠保水性。此外,蛋白凝膠NMR 弛豫時間測定結果與保水性結果一致,但與張鐵濤等[35]的試驗結果相反,這可能是由于椰肉蛋白為植物蛋白,而PPP 和EPI 為動物蛋白,二者變性溫度不同造成的。

本研究結果表明,PPP 和EPI 可與MP 形成良好的凝膠體系,在實際應用中,對改善肉類制品的凝膠特性具有一定的應用潛力,同時可以提高畜禽副產品PPP 和EPI 的利用率。綜上,今后在預乳化體系中進行脂肪替代品研究具有一定借鑒作用,同時PPP 和EPI 作為脂肪替代品與MP 的相互作用效果有待進一步研究。

4 結論

本試驗探討了PPP、EPI 和SC 3 種不同畜產源蛋白對MP 在流變、質構、保水和核磁的影響,發現PPP和EPI 在加熱過程中可以形成凝膠,而SC 加熱后不能形成凝膠;PPP、EPI 與MP 會發生相互作用且相互作用指數均大于0,加入PPP 所形成的MP+PPP 凝膠與MP 相比無明顯差異,而加入EPI 后的形成的MP+EPI 凝膠強度顯著高于MP,加入SC 不能對MP 的凝膠性質起到較好的作用效果,未能發生良好的交聯,與MP 凝膠強度存在明顯差異。在保水性方面,添加PPP、EPI 后均能較好地改善MP 的保水性,與MP 保水性存在明顯差異。綜上所述,在肉類制品中,可自身成膠的PPP、EPI 具有一定的應用潛力,對未來凝膠類肉制品的質構調節及基于預乳化的脂肪替代品研究有一定借鑒作用。