大米蛋白質中砷分布規律研究

邢常瑞 章 鋮 楊 鍇 董 雪 鞠興榮 袁 建 何 榮

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心；江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室， 南京 210023)

大米蛋白及其功能性產品具有致敏性低、氨基羧含量高、比例合理等優點，近年以來在嬰幼兒產品和高端產品領域具有廣闊的開發前景。然而隨著中國工業化快速發展，部分省市以污染環境為代價導致土壤中重金屬污染嚴重。這些重金屬通過“天氣-河流-土壤-植物”的自然循環系統富集在植物中，并通過食物鏈進入人體從而引發一系列疾病，危害生命健康[1]，如日本富山縣“痛痛病”事件。鎘易于在腎臟中累積，進而可能損害腎臟所處的泌尿系統，主要表現為近端腎小管功能障礙[2]。重金屬鉛進入人體后會溶于血液中，進而阻礙血細胞的合成，導致貧血。長此以往，會對人體的血液循環系統，消化系統，神經系統，免疫系統產生巨大危害。根據聯合國報道，在貧困地區的居民，長期飲用被砷污染的地下水會造成多器官的細胞毒性，甚至是癌癥[3]。

水稻是較易富集重金屬的主糧之一，重金屬鎘、鉛、砷更易于與大米的蛋白質結合?？讘c新[4]對受污染大米可能鎘分布部位的實驗探究，得出鎘主要與米胚乳中的谷蛋白絡合而存在，是一類金屬鎘與蛋白質形成的絡合物。陳露等[5]采用Osborne分級法提取秈糙米(鎘含量215.31 μg/kg)中的4種蛋白質(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白)，發現4種大米蛋白中的鎘含量分別為0.66、0.31、0.63、0.23 mg/kg，清蛋白中鎘含量最高。楊居榮[6]采用組織化學及溶劑提取法研究發現，Cd、Cu、Pb在稻谷和小麥籽實中優勢形態是蛋白質結合態，并且球蛋白和谷蛋白結合Cd的比例高。然而，到目前為止，鮮有報道分析砷與大米結合蛋白的特征和相關的理化性質以及結合機理。

本實驗選取砷污染較嚴重的大米為研究對象，通過Osborne法的原理連續提取各級蛋白質，并結合聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、紫外掃描分析(UV)和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)等方法對砷結合蛋白質進行性質表征。利用電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)定量分析不同大米蛋白中重金屬含量，并結合氨基酸組成分析研究特征蛋白氨基酸組成，得出砷在稻米中的分布規律，為后續稻米砷消減技術和開發優質米蛋白產品、響應國家優質糧食工程建設提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

實驗樣品為采集的砷污染嚴重的大米(粳稻、產自湖南某地、2017年秋)。取重金屬污染大米適量，用礱谷機將稻谷外殼去掉，保留糙米，然后用萬能粉碎機將糙米磨成粉末，過60目篩得到糙米粉，待用。

1.2 試劑與儀器

石油醚、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、硝酸、過硫酸銨、Tris-HCl、過氧化氫、濃硝酸、溴化鉀、聚丙烯酰胺凝膠電泳相關試劑、ZipTip C4微量層析柱、SA基質溶液。

JXFM110錘式旋風磨；CEM MARSX微波消解萃取裝置；7700x電感耦合等離子質譜儀；pHS-3C型精密數顯pH計；5800MALDI-TOF-MS基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜；BLH-3250型實驗礱谷機；JNMJ6型檢驗碾米機；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀；RE-5299旋轉蒸發儀；U-3900紫外可見分光光度計；Bio-Red 165-8001 小型垂直電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 大米中蛋白的提取與純化

根據4種蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白)溶解度的差異，分別以蒸餾水，5% NaCl溶液，70%乙醇溶液，0.05 mol/L NaOH溶液作為主要溶劑，采用Osborne法分步提取四種蛋白。每次室溫攪拌提取時間2 h，固液比4∶1，通過離心(10 000 r/min，10 min)分離沉淀蛋白，每步重復提取3次。合并提取液并通過0.45 μmol/L過濾，通過滴加2 mol/L HCl調節等電點沉淀提取液中的蛋白質，進行冷凍干燥，-20 ℃保存。具體提取步驟見圖1。

1.3.2 SDS-PAGE電泳

將分離得到的適量清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白，谷蛋白分別溶于蒸餾水，5%(m/V) NaCl溶液，70%(V/V)乙醇溶液，0.05 mol/L NaOH溶液制成0.3%(m/V)蛋白樣液。并分別吸取各蛋白樣液10 μL，加入上樣緩沖液30 μL于2.5 mL離心管中，沸水浴加熱3 min備用。配制10%(m/V)分離膠，5%(m/V)濃縮膠。連接電泳槽，裝入已制備好的凝膠，在電泳槽中加適量電泳緩沖液，依次緩慢滴加Marker，蛋白樣液各10 μL。凝膠電泳初始電壓設置為70 V，待條帶跑至黑線時，加大電壓至120 V。凝膠電泳結束后將凝膠小心取下，置于考馬斯亮藍染色液中搖床振蕩40～60 min，后置于脫色液中搖床振蕩約180 min，最后使用凝膠成像系統拍照。

1.3.3 MALDI-TOF-MS檢測

用ZipTip C4對蛋白樣品進行脫鹽，在樣品靶上點樣1 μL蛋白樣品并風干，加入0.6 μL SA基質溶液點后風干，在旁邊做標準樣對照。選取線性方法在正離子條件下進行相關樣品的校準測試，并用線性方法測試蛋白樣品的分子質量。

1.3.4 紫外掃描分析

將適量清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白，谷蛋白分別溶于蒸餾水，5%(m/V) NaCl溶液，70%(V/V)乙醇溶液，0.05 mol/L NaOH溶液制成0.1%(m/V)蛋白樣液。分別以蒸餾水、5%(m/V) NaCl溶液、70%(V/V)乙醇溶液、0.05 mol/L NaOH溶液作為空白進行基線校正，再對同溶劑的蛋白溶液在200-800 nm范圍內的紫外吸收強度進行掃描測試。

圖1 Osborne分級法提取糙米中的蛋白質

1.3.5 傅里葉紅外光譜儀檢測

采用壓片法進行傅里葉紅外光譜檢測，樣品與KBr的比例約為1:100于研缽中研磨均勻，并用壓片機進行壓片。在400～4 000 cm-1范圍內對樣品進行掃描測量，分辨率為4 cm-1。

1.3.6 砷含量檢測

準確稱取0.3 g樣品于消解管中，并加入2 mL 30%(V/V)過氧化氫溶液以及5 mL 65%(V/V)濃硝酸，置于通風櫥靜置40 min后，將消解管放入微波消解萃取裝置中消解60 min，待消解完畢后，放入電加熱器中設定160 ℃，進行趕酸，趕酸結束后用2%稀硝酸將消解管中樣品定容至10 mL容量瓶，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，用電感耦合等離子質譜儀(ICP-MS)測試樣品中砷含量。

1.3.7 蛋白氨基酸組成分析

稱取0.2 g樣品放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl后密封，于110 ℃的烘箱下水解24 h。將水解液用旋蒸儀進行旋蒸以除去鹽酸，后加入0.02 mol/L HCl定容至50 mL，吸取少量水解液經0.22 μm濾膜過濾，裝入進樣瓶中，采用氨基酸分析儀中對各個蛋白進行氨基酸組成分析。

1.3.8 數據處理與統計

數據用IBM SPSS 22.0進行分析和處理，圖表用Origin Pro 2016繪制。

2 結果與討論

2.1 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE測試結果如圖2所示，用Osborne法分步提取4種蛋白中，醇溶蛋白有一條清晰的條帶，分子質量在14.2 ku左右，表明醇溶蛋白是一個相對單一的組分；清蛋白有3個條帶，分子量分別在14.0、20.1、35～37 ku左右；球蛋白有2個條帶，分子質量分別在18.5～19.5、37.0 ku左右。谷蛋白比較復雜，存在4個條帶，分子質量分別在14.6、20～21、31、37.1～38.0 ku左右。該電泳結果與李亦蔚[7]提取和分離大米蛋白的研究結果較一致。說明了此提取、分離、純化方法能制備出純度均一的各級大米蛋白。

圖2 SDS-PAGE測試結果

2.2 MALDI-TOF-MS分析

通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF-MS)測定分子質量，結果如圖3所示。比較4種大米蛋白可知，醇溶蛋白只有一個較明顯的峰，分子質量約為14.1 ku，這點與之前的電泳圖所得結果較一致，陳露在提取分離得到的鎘硫蛋白也發現了類似的結果[5]，這表明該醇溶蛋白是一類低分子量的，純度單一的結合蛋白，其余蛋白的曲線圖譜與電泳圖譜基本一致，推測其余蛋白可能是多種不同分子質量的蛋白質，也有可能是含有多個亞基。

圖3 大米醇溶蛋白(a)、球蛋白(b)、清蛋白(c)和谷蛋白(D)的MALDI-TOF-MS測試結果

2.3 紫外掃描分析

以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標。各蛋白紫外圖譜如圖4所示，從圖4可以看出，醇溶蛋白在257 nm處存在吸收峰，已有報道發現通常在250 nm處存在鎘硫蛋白特征吸收峰[8]，因此可以初步得到該類蛋白是一種典型的金屬硫蛋白。清蛋白在242 nm左右處有強吸收峰，推測該處可能為該砷清蛋白特征吸收峰。

圖4 特征蛋白紫外圖譜

2.4 傅里葉紅外光譜儀分析

圖5 大米中醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白、球蛋白的FTIR圖

2.5 大米蛋白中重金屬分布規律研究

前期研究中發現隨著加工精度的增加，重金屬去除率也隨之增加。在碾米時間為120 s條件下，As總去除率達到42.57%，說明砷在糙米外層含量很高，很可能以砷蛋白形態存在[11]。楊居榮等[12]研究發現出米率為68.6%的精米，與原稻谷相比鎘的去除率可達24.10%，這是由于稻米籽粒中約40%的鎘富集在占稻米總重9%的糊粉層中，而占稻米總重約71%的胚乳中僅富集了45%的鎘。因此本實驗選用去殼的糙米作為原料，制備米粉，來研究大米蛋白質中砷的分布具有現實意義。

首先測定砷污染稻谷的重金屬含量并對分離得到的四種大米蛋白進行重金屬含量分析如表1所示，結果表明：污染大米中砷含量為0.242 mg/kg。通過分離得到的清蛋白中砷含量最高達到2.190 mg/kg，其次谷蛋白砷含量達到0.489 mg/kg，球蛋白和醇溶蛋白砷含量分別為0.110、0.076 mg/kg。砷與蛋白質結合緊密，由此推斷其結合強度依次為：清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。根據提取所得的四種蛋白質量以及對應的蛋白重金屬含量，對比原始樣品的質量和重金屬含量(蛋白質量未給出)，計算得到四種蛋白砷含量占砷污染樣品中的63.17%，清蛋白的砷含量占總樣品的26.03%，表明砷污染大米中砷與清蛋白的結合態為優勢形態。

表1 大米及大米蛋白砷含量

2.6 氨基酸組成分析

表2分析了4種蛋白之間氨基酸含量的差異，以及砷結合蛋白后蛋白氨基酸含量的變化。由于無砷污染大米的球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，與砷結合的球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白之間的氨基酸含量差異較小(該部分數據未給出)，因此選用無砷污染大米的清蛋白與砷結合清蛋白進行比較和分析砷對蛋白氨基酸含量的影響。

表2 蛋白樣品氨基酸組成

比較表3中數據發現，幾種蛋白樣品的脯氨酸、谷氨酸的含量整體較高，半胱氨酸的含量整體較低。值得注意的是砷結合醇溶蛋白中脯氨酸含量遠遠高于砷谷蛋白，兩者相差29.21%；而砷結合谷蛋白中谷氨酸含量高達19.39%明顯高于其他樣品，該結果與劉珊珊[13]研究鎘結合蛋白所發現的規律較一致。另外比較各種大米蛋白，發現砷結合蛋白中疏水性氨基酸含量較高，推測砷可能通過與疏水性氨基酸中的特征基團結合的方式形成砷結合蛋白。

砷結合清蛋白與無砷污染的大米清蛋白相比，重金屬砷的存在提高了大米中天冬氨酸的含量，并降低了賴氨酸含量，該規律與王凱榮[14]等人鎘污染對稻米品質的影響中所發現的規律較為一致。并且砷結合清蛋白與無污染的大米清蛋白相比，脯氨酸含量提高了10.14%，推測在砷結合清蛋白中，金屬砷可能通過脯氨酸與蛋白質結合。

3 結論

本研究對砷污染的大米進行連續提取，分離得到大米醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白和谷蛋白。通過SDS-PAGE、MAlDI-TOF-MS、紫外光譜以及傅里葉紅外光譜等方法對四種蛋白表征后，發現砷與蛋白質結合緊密，砷與蛋白質結合的強度依次為：清蛋白>谷蛋白>球蛋白>醇溶蛋白。通過ICP-MS與氨基酸組成分析獲取了砷在四種蛋白質中的分布規律：四種蛋白砷含量占砷污染樣品中的63.17%，清蛋白的砷含量占總樣品的26.03%，由此推測砷與清蛋白是優勢的結合態；砷結合蛋白中脯氨酸含量明顯高于其他樣品，由此推測砷主要與蛋白中的脯氨酸進行結合。