染色體拷貝數變異測序(CNV-seq)對稽留流產絨毛組織的病因學檢查分析

張卉 祖淑靜 張寧 單飛 楊威

(哈爾濱市紅十字中心醫院，黑龍江 哈爾濱 150076)

稽留流產又稱過期流產，指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內未及時自然排出者。胚胎或胎兒染色體異常是早期流產最常見的原因，約占50%～60%，染色體異常包括數目異常和結構異常。其中數目異常以三體綜合征居多，常見的有13、18、21、16和22-三體，其次為X單體，三倍體和四倍體少見。結構異常引起流產并不常見，主要有平衡易位、倒置、缺失、重疊及嵌合體等[1]。

染色體拷貝數變異測序(copy number varaition sequencing,CNV-seq)是采用高通量測序(next generation seqencing,NGS)技術對樣本DNA進行低深度全基因組測序，將測序結果與人類參考基因組堿基序列進行對比，通過生物信息分析發現樣本存在的拷貝數變異(CNVs)。具有流程簡單、易操作、通量高、兼容性好、所需DNA樣本量低等優點，樣本可為外周血、羊水、臍血、絨毛組織等[2]。為臨床檢測染色體疾病提供新的解決手段，可發現染色體非整倍體及染色體微缺失/微重復等。CNV-seq技術可用于產前診斷、流產原因排查、不孕不育原因查找，以及疑似染色體疾病患者的染色體異常檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2017年1月至2019年3月在哈爾濱市紅十字中心醫院婦產科門診臨床診斷的224例稽留流產患者，患者身體健康狀況良好，單胎。經產前診斷門診遺傳咨詢自愿接受流產病因學檢測的患者，進行檢測前咨詢，告知CNV-seq技術檢測目的及意義，行人工流產時留取絨毛組織送檢行CNV-seq。年齡在20～42歲，孕齡12周內的患者。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本的采集對臨床明確稽留流產的患者夫婦進行檢測前的遺傳咨詢并簽署知情同意書。收集稽留流產患者的絨毛組織(無菌操作，無污染)取50～100g，放入生理鹽水中多次漂洗，漂洗至無血液成分，取黃豆粒大小的絨毛組織放入PE管密封管內，及時送檢。

1.2.2 將采集到標本送檢至北京貝瑞和康生物技術有限公司。

1.3 CNV-seq實驗方案及流程圖，詳見表1、圖1.

表1 CNV-seq技術實驗方案

圖1 CNV-seq實驗流程圖

1 4 數據分析把檢測的DNA序列數據和基因組數據庫進行比對，得到樣本中每條染色體上可比對的唯一序列含量，根據生物信息學分析，計算出每條染色體的覆蓋深度值，并轉化為衡量染色體異常風險的指數。樣本中某一染色體DNA(chr N)所占總DNA比例可以表示為覆蓋深度Cov-chr N。然后對深度進行修正，通過樣本染色體的Cov-ratio來判斷胎兒染色體拷貝數是否異常，統計檢驗的值為Cov-ratio值，Cov-chr N以及Cov-ratio值計算如下：覆蓋深度Cov-chr N=樣本染色體N上唯一序列片段總數/參考序列染色體N上唯一序列片段總數；樣本的chr N的Cov-ratio=chrN的修正深度/平均修正深度；樣本的Cov-ratio值>1.3判定為樣本染色體重復，Cov-ratio值<0.7判定為樣本染色體缺失。

2 結果

2.1 CNV-seq結果 224例稽留流產絨毛組織，檢測出染色體畸變114例，其中陽性檢出率為51%(114/244) ，其中數目異常71例，占31.70%，其中包括特納綜合征20例、16-三體19例、22-三體7例、21-三體6例、13-三體3例、14-三體2例、20-三體1例、18-三體1例、15-三體1例、8-三體1例、4-三體1例、三倍體8例。詳見表2。

表2 CNV-seq陽性結果(染色體數目異常)

2.2 CNV-seq結果根據測序及統計每條染色體的唯一序列片段所得出的結果分析，CNV-seq發現染色體畸變陽性率為51%(114/224)，單純數目異常為31.70%(71/224)，嵌合體為3.12%(7/224)，其它染色體畸變包含微缺失/微重復為16.07%(36/2224)。臨床意義不明的拷貝數目變異(Copy number variants of uncertain significance，VUS)，即未確定性質的已報道DNA異?；蛭匆妶蟮赖男伦儺?，尚不能確定與其表型意義可能與稽留流產有無關系。詳見表3。

表3 CNV-seq陽性結果(染色體畸變除去數目異常以外嵌合體、部分微缺失/微重復)

注：高通量測序DNA測序查詢的數據庫：DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數據庫資源。

3 討論

3.1 稽留流產是胚胎停止發育未及時排除體外胚胎停止發育的主要原因之一是胚胎染色體異常，導致染色體異常的原因目前無明確定論，高齡是高危因素，與環境、感染、免疫、不良因素也有相關性。檢測胚胎染色體異常的方法有染色體核型分析、熒光原位雜交(FISH)、高通量DNA測序等技術。染色體核型分析常用G顯帶技術能夠檢查出絕大多數的染色體的異常情況，包括染色體數目異常如三體型、單體型、多倍體，染色體結構異常如易位、倒位及10Mb以上的片段缺失、重復等。染色體核型分析應用范圍廣、應用時間較長，檢測結果比較受臨床醫師信賴，是對絨毛、羊水或臍血進行產前診斷的主要方法和金標準。染色體核型分析技術檢測流產絨毛組織染色體的研究已經比較深入。在國外，早在1975年就有學者報道了1500例自然流產組織樣本之后發現約有60%的絨毛染色體數目異常，主要為非整倍體和多倍體[3]。國內學者們在染色體核型分析技術檢測絨毛染色體方面也做了大量研究：歐陽魯平等[4]利用傳統核型分析技術檢測了1160例早孕期流產絨毛樣本，檢測成功1140例，檢測成功率為98.2%，檢測出62例染色體異常核型，占5.44%，其中數目異常共32例(51.6%)，以45,X最多見，共 15例，其次是13-三體6例，結構異常5例，嵌合體22例。本研究對224例稽留流產絨毛組織進行CNV-seq檢測，共檢測出71例數目異常，45,X最多見,共20例，16-三體19例，22-三體7例也是導致流產的主要原因，這與孫義錫[5]的研究結果一致。與歐陽魯平等[4]研究結果相近。CNV-seq比較核型分析技術，對檢測標本要求較低，分辨率及檢測成功率高，成為快捷、準確、靈活的新型檢測手段[6]。隨著高通量測序技術的成熟與發展，全基因組測序被應用到各種領域，尤其是遺傳性疾病的研究方面備受關注。目前人類已知疾病中，大約有4000多種疾病與基因異常有關[7]。在傳統細胞遺傳學只能檢測5Mb以上的缺失和重復，5Mb以下隱藏著眾多的微小不平衡，是細胞遺傳學檢測難以診斷的。

3.2 FISH與傳統染色體核型分析技術 FISH有著快速、高效等特點，但也存在一定的局限性。FISH技術現階段只能針對已知的染色體非整倍體異常進行檢測，根據目前的研究，三體型可發生在除了1號染色體以外所有的染色體，而目前在臨床上使用的FISH探針只涉及13、16、18、21、22、X和Y這7條染色體，不能覆蓋所有染色體組，這將會漏診和誤診。臨床常用21、18、13、X、Y 五條探針。FISH技術只能檢測染色體的數目異常，并不能對染色體結構異常進行檢測。也不能檢測染色體微小變異，也就是說，FISH檢測結果為陰性的樣本，并不能說明該樣本不存在由易位、倒位、缺失及重復等結構異常所導致的染色體核型異常。據文獻報道，有15%～30%的核型異常是FISH不能檢測出來的[8]。FISH存在有一定的假陽性率和假陰性率。有文獻進行了大樣本的研究，分析了29039例樣本只有1例假陽性(假陽性率=0.003%)和7例假陰性結果(假陰性率=0.024%)[9]。

3.3 CNV-seq 應用本研究224例檢測成功率100%，陽性樣本占總樣本率51%(114/224)，低于范寶光等[10]研究的64.15%，徐蕾等[11]研究的79.59%。單純數目異常為31.70%(71/224)，嵌合體為3.12%(7/224)，其他染色體畸變包含微缺失/微重復為16.07%(36/2224)。文獻報道[12]流產染色體異常16-三體最多見，其次21-三體和22號三體。Jiandong Shen等[13]采用高通量測序技術檢測了 436 例流產絨毛樣本，檢出異常核型樣本 225 例，占 51.6%，包括188 例非整倍體異常，23 例片段微缺失微重復，及 14 例三倍體。1978年顧世光報道，早期稽留流產中 30.5%～54.9%的流產兒具有異常染色體[14]。趙佳[15]等人對 1032 例大樣本流產絨毛樣本進行檢測，檢出異常核型445 例，異常率 43.12%。我們研究224例稽留流產患者中特納綜合征20例，16-三體19例，22-三體7例，21-三體6例，也是比較常見，與文獻報道基本相符合。其次13-三體3例，14-三體2例，20-三體1例，18-三體1例，15-三體1例，8-三體1例，4-三體1例，三倍體8例。特納綜合征病例大多數在胚胎期流產。本研究檢測20%以上的染色體嵌合及染色體微缺失/微重復變異。其他染色體畸變包含微缺失/微重復為16.07%(36/224)。

3.4 CNV-seq的優勢與細胞培養核型分析相比其特異性、敏感性在檢測染色體數目異常上具有較高的一致性，能夠精確分析，利用Hiseq2500測序快速要得到結果，在時間上有較大優勢。由于不需要進行細胞培養，減少了細胞培養失敗的可能性。相較于染色體核型分析和FISH技術，采用高通量基因測序技術對流產絨毛進行檢測有以下幾方面的優勢。第一，高通量測序又可稱為新一代深度測序，是指一次性能并行測序幾百萬到十億條DNA分子，可對一個物種的轉錄組和基因組進行更深入、更全面、更細致的分析[16]。以Solexa技術為例，采用了該技術的Hi Seq 2500 測序儀，一臺機器在短短兩周的時間內能產出超過300G 的數據，這相當于把人類基因組重復測序100遍以上，短時間內大輸出量的測序與以往技術相比較最突出的優勢。第二，實驗對樣本要求較低，即使絨毛樣本退化只要DNA含量達到一定的測序要求就能對樣本進行檢測，這就很大程度上提升了樣本的檢測成功率。第三，對于染色體結構異常，該技術可檢測到100kb以上的染色體片段的微缺失和微重復，提高了染色體異常的檢出率。而以往使用染色體核型分析技術只能排查出10Mb以上的染色體結構異常，這就導致很多存在細微結構異常的染色體被漏診，所以有學者認為，早期自然流產絨毛的染色體異常率實際上應該高于普遍報道的50%[17]。有文獻報道，通過大樣本量的研究，采用高通量檢測技術對智力低下的患者進行遺傳學分析，發現這些患者存在染色體結構上的微缺失微重復[18]。

3.5 CNV-seq結果解讀分析絨毛組織染色體畸變是否存在，如結果無異常時，可以基本排除稽留流產非遺傳物質染色體畸變所致，建議夫妻進行其他檢查。流產原因還有精子畸形率、免疫、感染環境等等。如染色體畸變為非整倍體多數是生殖細胞成熟或受精卵早期卵裂過程中，染色體不分離或丟失等原因造成的[19]?；袅鳟a的病因可能與夫妻年齡、情緒、孕前孕期接觸有毒有害物理、化學、藥物等不良環境相關。如染色體畸變為缺失/重復，考慮拷貝數變異是新發突變還是來源于親本(夫妻之一)，夫妻均需行CNV-seq檢測。無論是新發突變還是來源親本再次妊娠均需進行遺傳咨詢及產前診斷。

總之，應用CNV-seq對稽留流產絨毛組織染色體畸變進行檢測能明確稽留流產的病因，有利于臨床醫師快速準確尋找稽留流產病因，對再次妊娠有重要的指導意義。