影響無創產前篩查準確性的因素分析

趙曉敏 郭穎 李姍姍 李雯 崔洪艷 常穎

(天津市中心婦產科醫院 產科、天津市人類發育與生殖調控重點實驗室，天津，300100)

NIPT(non-invasive prenatal testing, NIPT)，即利用母體外周血中胎兒游離細胞DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)進行大規模平行測序[1, 2]。自從2011年NIPT正式引入臨床[3, 4]，其應用價值就備受臨床醫生和科研人員的關注。隨著科學技術的進步，目前NIPT的篩查范圍已不僅僅是常見染色體三體(21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征)，還包括性染色體非整倍體、罕見染色體異常以及特定微缺失、微重復綜合征的篩查[5]。然而，隨著篩查范圍的不斷擴大，迫切需要大量數據進一步證實其臨床可行性[6, 7]。NIPT的準確率受多種因素影響，統一的篩查標準，嚴格的質控是NIPT應用于臨床的重要前提。

隨著研究的不斷進展，發現染色體亞顯微結構的缺失和重復并不少見，有報道指出在常見三體高風險而超聲結構正常的胎兒中，有臨床意義的微缺失、微重復綜合征的發生率為1%～1.7%[8]。 微缺失、微重復綜合征在產前較難發現的原因分為以下兩點：①產前異常較為微小或者常規的產前超聲檢查難以發現，目前產前超聲異常小于40%是在中期超聲篩查中發現，而早期并無結構異常發生；②不同于非整倍體，存在高齡等明確的危險因素。大多數拷貝數變異(copy number variants，CNVs)缺乏明確的危險因素。因此，目前將cffDNA用于微缺失、微重復綜合征的篩查對于產前遺傳咨詢專家和患者來說都面臨著巨大的挑戰。

本研究的目的是對影響NIPT準確性的相關因素進行分析。明確其適用人群，加強質量管理，進一步提高其陽性預測值。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取2015年1月至2017年11月因胎兒NIPT結果異常(多家檢測公司)進一步于天津市中心婦產科醫院行羊膜腔穿刺進行產前診斷的病例。納入標準：①單胎、活胎妊娠；②羊水清亮，無混血；③父母無家族性遺傳性疾病、無血液系統傳播疾病及先天性免疫缺陷??；④自然受孕，排除促排卵、胚胎移植等輔助生殖技術的妊娠。

1.2 研究方法 收集的數據包括人群的基本信息(身高、體重、 年齡、孕周、孕次、產次)，部分胎兒頸部透明層厚度、NIPT結果和羊膜腔穿刺結果。由于納入病例NIPT檢測公司不同，對于性染色體異常并無統一報告標準，然而NIPT對于不同類型性染色體數目異常的檢出率并不相同，因此將NIPT結果分類為：常見染色體三體(21-三體、18-三體、13-三體)高風險、性染色體數目偏多、性染色體數目偏少、性染色體數目異常、罕見染色體異常,將產前診斷結果與產前篩查結果進行對比分析。同時，研究孕婦年齡、身體質量指數(body mass index，BMI)等因素是否影響篩查結果的準確性。

2 結果

2.1 樣本分布分析 最終納入NIPT異常結果病例共441例，人群一般特征見表1。 對441例患者進行羊膜腔穿刺產前診斷并對NIPT和羊膜腔穿刺結果進行分類統計，計算其真陽性(true positive,TP)例數，陽性預測值(positive predictive value, PPV)和假陽性率(false positive rate, FPR)(表2)，本研究對于真陽性例數的納入標準包括：①篩查結果與產前診斷結果完全相符；②診斷結果為高度嵌合(如：NIPT為13三體，而產前診斷結果為13三體的高度嵌合)；③部分相符：如NIPT結果為13三體，而產前診斷結果為三體中的一部分為13-三體。符合以上任意一項即為真陽性。真陰性病例則為NIPT與產前診斷結果完全不符。NIPT 21-三體高風險、18-三體高風險、13-三體高風險、性染色體數目偏多、性染色體數目偏少、性染色體數目異常、罕見染色體異常納入例數分別為149例、49例、24例、81例、53例、26例、59例，最終產前診斷確診的例數分別為116例(78.0%)、22例(45.05%)、5例(21.0%)、54例(67.0%)、9例(17.0%)、9例(35.0%)、7例(12.0%)。

隨著NIPT技術水平的不斷提高，罕見染色體異常正逐漸被納入其篩查范圍， 本研究中NIPT發現罕見染色體異常59例(染色體數目異?；蚩截悢底儺?，產前診斷最終證實7例與篩查結果一致，準確率較低，因此NIPT用于罕見染色體異常的篩查仍然需要進一步研究。

2.2 孕婦年齡因素對于篩查結果準確性的影響 為了進一步探討年齡因素對于篩查結果準確率的影響，將NIPT提示21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體異常的441例患者根據年齡分為兩組：高齡組(≥35歲)和適齡組(18～34歲)，高齡組139例，羊膜腔穿刺核型分析最終結果39例為46，XN，100 例為染色體非整倍體且與篩查結果相符；適齡組243例，羊膜腔穿刺核型分析最終結果127例為46XN，116例為染色體非整倍體且與篩查結果相符(表3)。統計學分析結果最終P=0(P<0.05)，孕婦年齡與篩查準確率具有統計學意義，說明高齡是影響NIPT準確率的因素之一。此外，兩組間孕次、產次統計學分析結果P<0.05，存在統計學差異。因此，對于年齡>35歲的妊娠婦女推薦直接進行產前診斷，本研究統計結果與我國母嬰保健法建議相一致。

2.3 孕婦BMI、胎兒頸項透明層厚度對于篩查結果準確性的影響 為了研究孕婦BMI對于產前篩查準確度的影響，我們隨機調查了187例孕婦的BMI(其中NIPT結果為常見染色體非整倍體或性染色體非整體的孕婦為105例)，根據BMI分類標準，進行統計(表4)。此外，本研究通過對比胎兒頸項透明層厚度(nuchal translucency, NT)，進一步驗證NIPT對于染色體非整倍體篩查的應用價值。441例NIPT異?；颊咧须S機調查了48例患者的早期NT數據，其中6例NT≥3.0mm的患者產前診斷最終證實5例為非整倍體，且與NIPT結果相符，1例為46XN。42例NT小于3.0mm的患者產前診斷最終證實21例為46XN，21例為染色體非整倍體，且與NIPT結果相符(表5)，采用Fisher確切概率進行統計分析，P=0.199(P>0.05)，因此，本研究中48例患者NT值的差異NIPT準確率的影響沒有統計學意義。

表1 人群一般特征

表2 cffDNA與產前診斷結果

表3 孕婦年齡與NIPT準確率的關系

注：由于NIPT用于罕見染色體異常的效果尚無確切數據，本表格中數據僅對NIPT提示21-三體高風險、18-三體高風險、13-三體高風險以及性染色體異常的病例進行統計

表4 孕婦BMI對于NIPT準確率的影響

(注：表中數據僅對NIPT提示21-三體高風險、18-三體高風險、13-三體高風險以及性染色體異常的病例進行統計)

表5 48例NIPT高風險患者NT值與產前診斷結果的關系

3 討論

染色體非整倍體是導致遺傳缺陷的主要原因，在活產兒中最常見的染色體非整倍體是21-三體(唐氏綜合征)，18-三體(Edwards綜合征)、13-三體(Patau綜合征)和性染色體非整倍體。大量研究表明，每800例新生兒中就有1例唐氏綜合征患兒[9]， 而且隨著二孩政策的開放，高齡產婦逐漸增多，染色體非整倍體的發生率逐漸增加，相關研究發現對于一位45歲的妊娠女性，胎兒發生21-三體綜合征的概率上升至1/35[10, 11].。 研究表明，NIPT對于21-三體和18-三體的敏感度高于99%，對于13-三體的敏感度為 78.6%～91.7%[12, 13]，而關于性染色體非整倍體敏感度的研究相對較少。本研究再一次驗證了NIPT對于21-三體的準確率最高(78.0%)，其次是18-三體(45.0%)，13-三體最低為21.0%。然而相對于大樣本研究數據，本研究中21-三體的準確率仍然較低，分析其可能的原因主要為以下幾個方面：①NIPT檢測公司不同，其準確率不同；②cffDNA的濃度受采血孕周的影響，孕周偏小會導致cffDNA濃度偏低，影響NIPT的準確率，本研究中所納入病例的采血孕周未知；③孕婦年齡、BMI等也是影響cffDNA濃度以及NIPT準確率的重要因素[14]，例如本研究中1例肥胖Ⅱ級和1例極度肥胖孕婦并不屬于進行NIPT的適應證，造成了假陽性的結果。因此，在產前篩查和診斷中應該進一步關注質控問題，減少假陽性和假陰性率的發生，更好地提高NIPT在臨床應用中的效力。近來，關于NIPT對于性染色體非整體準確率較低的原因分析備受關注，可能的原因是NIPT篩查的遺傳信息即cffDNA，來源于胎盤滋養層細胞而不是真正的胎兒細胞[15]。因此，當存在性染色體的局限性胎盤嵌合時會造成NIPT假陰性或假陽性結果[16]。所以，這也是NIPT篩查相對于傳統核型分析的局限性之一。

目前將NIPT用于篩查微缺失、微重復綜合征引發熱議。不同于非整倍體篩查，大多數常見的微缺失、微重復綜合征不受年齡因素影響。有研究認為，NIPT篩查特定的微缺失、微重復綜合征可以減少不必要的產前診斷以及減少臨床意義不明的CNVs出現，有效降低了遺傳咨詢的壓力，減少患者及家屬不必要的焦慮。然而值得提出的是，臨床中尚不能提供充足的數據以證明其敏感度、陽性預測值等。本研究中441例NIPT高風險中59例為罕見染色體數目異?；駽NVs，產前診斷最終證實7例存在異常且與NIPT結果一致，4例存在異常但與NIPT結果不一致。 NIPT對于罕見染色體異常的準確率較低，與相關文獻結論一致[17]。由于本研究中例數較少且CNVs自身發生率較低，因此，尚不能說明NIPT用于這一領域的準確性。此外，相關指南目前尚不推薦將NIPT用于篩查所有CNVs，僅用于特定的CNVs。因此，對于選擇NIPT進行微缺失、微重復綜合征篩查的孕婦，應告知NIPT技術目前的局限性，以便更好的進行遺傳咨詢工作。

伴隨二孩政策的開放，高齡產婦逐漸增加。本研究中高齡孕婦占總體的35.8%，NIPT高風險的高齡組孕婦與適齡組孕婦發生染色體非整倍體的概率存在統計學差異P=0(P<0.05)。高齡組的染色體非整倍體發生率較適齡組高。因此，本研究認為NIPT對于非整倍體產前篩查有著很大的優勢，ACOG指南[18]指出NIPT適用于35歲以上所有孕婦,但是，我國目前尚無相關共識及指南,仍需大數據的積累,同時需考慮其經濟成本效益。

總之，相對于傳統的篩查方法，NIPT有著更多的優勢，而且隨著NIPT技術水平的不斷提高，其在產前篩查中會有著更加廣闊的應用前景。當然，這一技術帶來效益的同時，也對臨床工作帶來了極大的挑戰。在臨床中應更加注重質控問題，應向患者及家屬告知NIPT篩查的局限性以及做好對篩查結果的遺傳咨詢工作[19]。 NIPT目前仍然主要用于常見染色體非整倍體以及性染色體異常的篩查。對于微缺失、微重復綜合征以及罕見染色體異常的篩查有待進一步驗證。需要說明的是，本研究例數較少，并且納入病例來源于多家NIPT檢測公司，仍然需要更多的數據進行支持。