東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)利用有機磷增殖研究

肖宇梅，徐雯欽，蘇玉萍，2*，張立香，佘晨興，廖福萍

(1.福建師范大學環境科學與工程學院，福建 福州 350007；2.福建省污染控制和資源循環重點實驗室，福建 福州 350007)

隨著我國對海洋開發力度的增大，海洋的生態環境和資源受到了嚴峻的考驗，海洋經濟的發展也受其影響。隨之引發的赤潮發生的頻率和規模也呈現上升趨勢。據統計，我國近海海域2001—2013年間引發赤潮的種類中以甲藻門為優勢種的有27種，次之以硅藻門為優勢種的有20種，其他如金藻門、藍藻門、黃藻門等，共60種[1]。東海近海海域已成為我國赤潮高發區之一，東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)也已成為該海域赤潮的優勢種[2]之一。相關數據顯示，2001—2013年東海原甲藻赤潮在我國每年均有爆發，其中2013年作為第一優勢種引發赤潮多達16次[1]。東海原甲藻屬于甲藻綱，原甲藻目，原甲藻科，原甲藻屬，主要在東海長江口、浙江近海至福建沿岸海域引發赤潮[3-4]。福建省是我國赤潮頻發的省份之一。據統計，福建省每年平均發生赤潮16.1起[5]。2013—2017年東海原甲藻赤潮共12起。東海原甲藻已成為海洋研究工作者密切關注的一個藻種，探討東海原甲藻赤潮的形成機制、預警應急以及藻種生長與環境因子的關系等已成為研究熱點。

磷(Phosphorus，P)是微藻生長的必需營養元素之一，也是大多數代謝結構和功能所必需的元素[6]。海洋中的磷主要以溶解性無機磷(Dissolved inorganic phosphorus，DIP)和溶解性有機磷(Dissolved organic phosphorus，DOP)存在，且因DIP在水生系統中含量較低而通常成為浮游植物生長的第一個限制因素[7-8]。Zhang等研究發現東海原甲藻對DIP限制表現出積極的生理和轉錄反應，DIP的限制影響東海原甲藻的生長速率[9]，同時也在劇毒卡爾藻(Karlodiniumveneficum)[10]和米氏凱輪藻(Kareniamikimotoi)中體現[11]。東海原甲藻可直接利用無機磷，但其可分泌堿性磷酸酶間接利用葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、三磷酸腺苷(ATP)和核糖核酸(RNA)等有機磷(Organic phosphorus，OP)化合物維持生長，與無機磷相比發現有機磷對東海原甲藻的增殖作用稍好，對堿性磷酸酶的測定也反映出東海原甲藻對有機磷的利用方式不同[12-14]。林森杰等發現缺磷條件下細胞周期G1期受阻，但在缺磷培養基中加入有機磷ATP后，ATP等可以完全補充東海原甲藻的無機磷源并迅速恢復細胞分裂，東海原甲藻的轉錄組和mRNA表達與有機磷利用相關的基因表達量顯著上調，說明東海原甲藻具有利用核酸、ATP、脂類等多種有機磷[15-16]包括葡萄糖-6-磷酸、磷肌酸、2-磷酸甘油酸、核苷酸、三磷酸腺苷等種類[13]的能力。

前人的研究主要集中在無機磷和有限種類的有機磷對東海原甲藻增殖的影響[13]。鑒于此，本文研究PM4A多磷源對東海原甲藻增殖的影響，選取了59種磷(54種有機磷、5種無機磷)作為磷源，探究東海原甲藻對有機磷的利用特性，結果對于研究東海原甲藻赤潮的發生規律和應對措施具有現實意義。

1 材料與方法

1.1 藻種的培養和有機磷

以東海原甲藻為研究對象，藻株來自于廈門大學海洋藻類資源研究中心(株CCMAXU-364)。所有藻類培養實驗均在光照培養箱中進行，光照采用白色冷光源，光照強度2 500 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度設置為(20±1)℃，培養期間每天定時微振細胞培養板，防止藻細胞黏附及缺氧。實驗用f/2培養基進行培養實驗。購自于美國Biolog公司的PM4A磷源板，提供了54種有機磷(DOP)和5種無機磷(DIP)。

1.2 實驗設計

實驗藻種先饑餓處理72 h以耗盡藻細胞內磷酸鹽。在紫外線滅菌后的超凈臺下，向PM4A plate微孔中加入100 μL滅菌海水，充分溶解微孔中磷營養物質作為實驗用磷源母液，將各微孔中的磷源母液轉移50 μL到細胞培養板對應微孔中。細胞培養板各微孔中分別加入150 μL磷饑餓處理后的東海原甲藻藻液，進行藻類培養實驗，實驗體積為200 μL，設置2組平行實驗。細胞培養板同時放置于同一個光照培養箱進行培養，培養周期為10 d。同時為防止孔板中的培養液蒸發和邊緣效應，2組培養板分別套上透明的塑封袋，并在空微孔中加入滅菌海水。接種后暫養1 d，次日起為第1天，之后每天定期放入酶標儀(Perlong DNM-9602)中檢測各微孔的吸光度。

1.3 測定和計算方法

1.3.1 細胞計數

在徠卡顯微鏡(Leica BM-E)下用0.1 mL(20 mm×20 mm)浮游生物計數框計數，根據公式(1)[17]計算細胞初始密度，考慮到實驗藻種增殖期間單個細胞的體積差較大，本實驗以生物量評價藻種在不同磷源中的生長情況。實驗東海原甲藻初始密度為1.04×107cells/L，于徠卡顯微鏡下拍照計算東海原甲藻的直徑大小并取其平均值，將東海原甲藻視為球體計算出體積，藻類的比重接近1，因此，可由藻類體積直接換算生物量(濕重)，藻類生物量為細胞密度乘以藻體平均體積，單位為mg/L或g/m3[17]，實驗藻種東海原甲藻的平均體積為0.08×10-4mg/L，由此初始生物量為83.20 mg/L。

(1)

式中，N為細胞豐度(cells/L)；S為計數框面積(mm2)；S0為計數視野面積(mm2)；V0為濃縮后體積(mL)；V為計數體積(mL)；n為計數所得藻類個數(cells)。

1.3.2 酶標儀分析

為了方便測量細胞數量，每天同一時間用酶標儀測定各孔板的OD值，檢測波長450 nm處的吸光度[18]。本研究先測定波長為450 nm下不同細胞密度(cells/L)對應不同生物量(mg/L)的藻體與OD值之間的線性關系，發現東海原甲藻生物量在OD450 nm線性關系較好。

藻體生物量(mg/L)=(OD450-0.136 1)/0.000 2(R2=0.927 2)

(2)

1.3.3 生長動力學參數

比生長速率(μ)的計算公式(3)[19]：

μ=(lnXt-lnX0)/t

(3)

式中，X0表示初始細胞生物量(mg/L)；Xt表示t天后細胞生物量(mg/L)；t表示天數(d)。

2 結果與討論

通過單培養東海原甲藻結果發現其對不同磷源的利用具有選擇性，圖1為不同時期單培養東海原甲藻時磷源生態位分布。根據每天計算的各微孔中的生物量水平和變化情況發現，培養第8天總體生物量水平達到最高，培養第9天生物量水平存在下降趨勢，培養實驗第10天結束。東海原甲藻對不同磷源利用的比生長率如圖2所示。

2.1 東海原甲藻對有機磷的利用差異

東海原甲藻對各磷源的利用效果和方式存在差異。由實驗結果得出有47種磷(5種DIP、42種DOP)可以被東海原甲藻利用。本研究發現東海原甲藻對磷酸乙醇酸(Phospho-glycolic acid)利用效果最好，次之D-甘露糖-1-磷酸(D-mannose-1-phosphate)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate)，三者可以促進東海原甲藻的增殖，第8天生物量分別高達1 107.00、802.00和619.50 mg/L，培養周期結束時第10天的比生長速率分別為0.249、0.214和0.209 d-1，東海原甲藻對部分核苷酸(3′-單磷酸胞苷，3′-AMP)、葡萄糖-6-磷酸(D-glucose-6-phosphate，G-6-P)、D-2-磷酸甘油酸(D-2-phospho-glyceric acid)的利用效果較好，3′-AMP能促進東海原甲藻的增殖，其比生長率為0.13 d-1；G-6-P比生長率為0.16 d-1；D-2-磷酸甘油酸比生長率為0.13 d-1。本研究結果與眾多學者在東海原甲藻對有機態磷的利用效果的研究方面的結果相似，說明東海原甲藻在天然海水中可利用的磷源種類較多，在無機磷限制的海域可能具有較強的增殖能力。

從事光呼吸作用研究的學者發現了磷酸乙醇酸為該反應過程提供原料。光呼吸作用曾被認為是無用的耗能過程，但近年來的研究結果表明光呼吸過程具有重要的意義，如緩解磷不足對于光合作用的限制，從而減輕光抑制[20]。這為解釋東海原甲藻對磷酸乙醇酸的利用效果最佳提供了一個可能原因。

關于藻類吸收利用有機磷的機理，許多學者都提出了自己的理論。洪華生等認為：一是對于小分子有機磷，其利用機制與無機磷相似，可以直接利用；二是對于大分子有機磷，可能需要通過藻類分泌如堿性磷酸酶等物質的作用，被間接利用[21]。林森杰等探究米氏凱倫藻對G-6-P的生物利用度及分子機制，發現G-6-P可以被直接利用，認為可能是因為其作為多種代謝途徑的底物，直接攝取能節省水解有機磷和磷酸化的能量[22]。而相比于直接利用，相關誘導酶的合成和分泌可能需要一段時間，這可能會造成藻體生物量水平變化的差異[13]。因此，在本實驗結果中，各種磷的利用效果的差異可能與藻類對不同磷源的利用機理和體內酶的種類有關，具體機理還有待進一步研究。

2.2 東海原甲藻對某些有機磷和無機磷的利用效果比較

由本研究實驗結果(圖1和圖2)所知，東海原甲藻對某些有機磷的利用效果與對無機磷的利用效果相當甚至更高。東海原甲藻利用的5種無機態磷：磷酸鹽、焦磷酸鹽、三偏磷酸鈉、三聚磷酸鹽、次磷酸鈉，其最高生物量(第8天)分別達到502.00、467.00、279.50、314.50、159.50 mg/L，培養周期結束時(第10天)生物量分別為362.00、379.50、147.00、182.00、89.50 mg/L，比生長速率分別為0.14、0.15、0.06、0.08、0.01 d-1。東海原甲藻對硫代磷酸鹽(酯)、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸、D-甘露糖-6-磷酸、六磷酸肌醇(植酸)在生物量最高和培養周期結束時的生物量水平均高于無機態磷，這6種有機磷和二硫代磷酸鹽、D-G6P等磷源培養的東海原甲藻比生長率也高于上述5種無機態磷。趙艷芳等利用NaH2PO4、G-P、ATP 和G-6-P等4種磷源對東海原甲藻進行培養，發現有機磷源對東海原甲藻的增殖作用效果比無機磷酸鹽稍好[13]，與本次實驗結果相似，這表明有機磷化合物在東海原甲藻赤潮的形成過程中可能發揮著不可忽視的作用。

2.3 東海原甲藻可利用的有機態磷的酯鍵比較

3 結論

1)東海原甲藻可以利用PM4A 板上59種磷源中的47種磷，其中無機磷5種、有機磷42種，但是利用效果各不相同，對磷酸乙醇酸、D-甘露糖-1-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的利用效果較好。

2)東海原甲藻對PM4A 板上的含有C-O-P酯鍵的有機磷利用效果更好，某些有機磷對于東海原甲藻的營養價值高于無機磷，這表明有機磷可能成為影響東海原甲藻類生長的重要磷源。