苦菜總黃酮超聲波輔助提取及抗氧化能力研究

單科開 王鴻飛 許 鳳 羅 潔 韓愛茹 李艷霞 邵興鋒 韋瑩瑩

(寧波大學食品科學與工程系,浙江寧波 315211)

苦菜(Sonchus oleraceusL.)為菊科(Compositae)苦苣菜屬(Sonchus)一年生或兩年生草本植物,又稱為苦荬菜、苣荬菜[1]。 我國苦菜資源十分豐富,主要分布在西北、華北、東北、華中地區,多生長在林下、山坡或平地田間。 苦菜作為藥食同源植物[2],富含對人體有益的內酯、萜類、酚酸、多糖、氨基酸及黃酮類化合物等成分[3-5],其中黃酮類物質與苦菜的藥用價值有很大的關系。 黃酮作為一種活性物質,具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝、保護心腦血管系統、抗病毒及殺蟲等廣泛的生理活性[6]。 因此,提取并研究苦菜中的黃酮具有重要的意義。

黃酮的提取方法主要有回流提取法、微波提取法、超臨界提取法、酶解法、機械力化學提取法、超聲波-乙醇提取法等[7]。 而苦菜中黃酮類物質的提取方法主要有超聲波法、回流提取法,翟碩莉等[8]通過超聲波水提法提取苦菜黃酮,得到苦菜黃酮的提取率為2.47%；戴水平等[9]利用乙醇回流提取苦菜根中的黃酮,提取率為3.66%。 為了提高黃酮提取率并降低成本,單一提取方法越來越不能滿足需求,復合法提取黃酮已成為主要趨勢。 研究表明,超聲波-乙醇提取法具有振動、空化、細胞破壁、熱效應、超聲湍流和流體邊界層等綜合效應,有利于植物細胞內容物向溶劑擴散,加速提取過程,從而縮短提取時間,減少溶劑用量[10-11]。 本試驗以干苦菜為原料,采用超聲波-乙醇提取法提取苦菜總黃酮,通過響應面法對提取工藝條件進行優化,并對苦菜總黃酮提取物的抗氧化能力進行研究,以期為苦菜總黃酮的提取及開發利用提供理論依據和科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干苦菜購自安國藥源商貿有限公司。

三吡啶三吖嗪[2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ],分析純(≥99%),美國Sigma-Aldrich 公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),日本和光純藥工業株式會；三羥甲基氨基甲烷(Tris Base),青島生工生物科技有限公司；鄰菲羅啉,阿法埃莎(Alfa Aesar)天津化學有限公司；蘆丁標準品(質量分數≥95%)、無水乙醇、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、L-抗壞血酸、結晶三氯化鋁,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Cary50Scan 紫外分光光度計,美國瓦里安技術中國有限公司；WK-200B 高速藥物粉碎機,山東青州市精誠機械有限公司；SB3200D 超聲波清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司；H1850-R 臺式高速冷凍離心機,湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦菜總黃酮的提取 參照王鴻飛等[12]的方法并略作修改。 將干苦菜粉碎,過60 目篩得苦菜干粉。精確稱取1 g 苦菜干粉,加入60%乙醇溶液,超聲波輔助提取(150 W,40 min),水浴浸提(60℃,60 min),經常溫離心(5 000 r·min-1,15 min)后將上清液進行抽濾,濾液定容至100 mL,備用。

1.3.2 苦菜總黃酮含量的測定 采用氯化鋁法[13]。精確稱取0.022 4 g 蘆丁標準品,用30%乙醇溶液定容至100 mL 容量瓶中,此時溶液的質量濃度為0.224 g·L-1。精密移取標準溶液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 比色管中,各加入1 mL 2%三氯化鋁溶液,用30%乙醇溶液定容至刻度,分別配置成質量濃度為0、0.004 48、0.008 96、0.011 20、0.013 44、0.017 92、0.022 40 g·L-1的蘆丁標準溶液,混勻靜置20 min,在270 nm 波長下測定其吸光度值。 以蘆丁標準溶液的質量濃度為橫坐標,以吸光度值A 為縱坐標作圖,進行線性回歸分析。 按照標準曲線計算苦菜中總黃酮含量,其計算公式為：

式中,y為苦菜總黃酮得率,%；m 為樣品液中總黃酮的質量,g；M 為干物料的質量,g。

1.3.3 單因素試驗設計 在超聲功率150 W、超聲時間1 h 的基礎條件上,以總黃酮得率為指標,分別考察乙醇濃度、浸提溫度分別設為浸提時間、料液比對苦菜總黃酮含量的影響。 其中,乙醇濃度分別設為20%、30%、40%、50%、60%、70%；浸提溫度分別設為40、50、60、70、80、90℃；浸提時間分別設為30、60、90、120、150、180 min；料液比分別設為1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70(m/v)。

1.3.4 Box-Behnken 試驗設計 單因素試驗結果的基礎上,以乙醇濃度(A)、浸提溫度(B)、浸提時間(C)、料液比(D)為自變量,總黃酮得率(Y)為響應值,采用Box-Behnken 設計法對苦菜總黃酮的提取工藝條件進行優化。 響應面試驗設計及因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計與因素水平Table1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 苦菜黃酮抗氧化能力的測定

1.3.5.1 苦菜黃酮總抗氧化能力的測定 采用FRAP 法[14]。 Fe3+還原力標準曲線的繪制：分別取濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol·L-1的FeSO4溶液各3 mL,然后加入3 mL FRAP 工作液,混勻后放置于37℃恒溫水浴中反應10 min,在593 nm波長處測定吸光度值。 以FeSO4濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,進行線性回歸分析。

分別取3 mL 不同質量濃度的苦菜總黃酮提取液,依次加入3 mL FRAP 工作液,混勻后于37℃條件下恒溫水浴10 min,在593 nm 波長處測定其吸光度值。 苦菜黃酮總抗氧化能力以用相同吸光度值的FeSO4濃度進行表示。 以相同濃度的維生素C(Vc)作為對照。

1.3.5.2 苦菜黃酮對DPPH 自由基清除能力的測定 參照楊娜等[15]的方法。 取3 mL 一定質量濃度的苦菜總黃酮提取液,加入等體積的0.2 mmol·L-1無水乙醇溶液,混勻后在黑暗處放置30 min,以無水乙醇作為空白組,在517 nm 波長處測定其吸光度值。 以相同濃度的Vc 作對照。 按照公式計算DPPH 自由基的清除率：

式中,A0為DPPH 溶液+無水乙醇的吸光度值；A1為無水乙醇+苦菜黃酮提取液的吸光度值；A2為DPPH 溶液+苦菜黃酮提取液的吸光度值。

1.3.5.3 苦菜黃酮對羥基自由基清除能力的測定 參照Fenton 法[16]中的分光光度法。 取2 mL 一定濃度的苦菜黃酮提取物,分別加入2 mL PBS 緩沖液(pH值7.4)、2 mL 0.75 mmol·L-1鄰菲羅啉無水乙醇溶液、2 mL 0.75 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 0.01%雙氧水及3 mL 蒸餾水,混合均勻后于37℃恒溫水浴中反應1 h,隨后迅速測定該混合溶液在536 nm 波長處的吸光度值。 以相同濃度的Vc 作對照。 按照公式計算羥基自由基的清除率：

式中,A0為PBS 緩沖液+鄰菲羅啉溶液+蒸餾水+FeSO4溶液的吸光度值；A1為PBS 緩沖液+鄰菲羅啉溶液+蒸餾水+FeSO4溶液+H2O2的吸光度值；A2為PBS 緩沖液+鄰菲羅啉溶液+FeSO4溶液+苦菜黃酮溶液+H2O2的吸光度值。

1.3.5.4 苦菜黃酮超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[17]。 鄰苯三酚自氧化速率測定：4.5 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH 值8.2)于37℃水浴中預熱20 min,加入4 mL 蒸餾水,均勻混合后于37℃條件下水浴20 min,隨后快速加入0.5 mL 3 mmol·L-1鄰苯三酚溶液(37℃水浴中預熱20 min)并開始計時1 min,1 min 后迅速搖勻倒入比色皿中,以10 mmol·L-1HCl 溶液調零,于325 nm 波長處每間隔30 s 測定該溶液的吸光度值。 以時間為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制線性回歸曲線,其斜率即為鄰苯三酚的自氧化速率(Ⅴ0)。

按照以上步驟,將加入4 mL 的蒸餾水替換為4 mL 不同質量濃度的苦菜黃酮溶液。 同樣以10 mmol·L-1HCl 溶液調零,測定其吸光度值。 按照同樣的方法進行線性回歸分析,斜率記為Ⅴ1。 按照公式計算超氧陰離子自由基的清除率：

1.3.6 數據處理 使用Origin Pro 9.0、SAS 8.1 和Design Expert 8.06 軟件進行數據統計分析、建立方程模型和作圖。 每試驗均重復3 次,取平均值。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

按照1.3.2 的方法繪制的蘆丁標準曲線見圖1。 其回歸方程為y=34.834x+0.012 1,相關系數R2=0.998 3。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度對苦菜總黃酮得率的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度的增加,苦菜總黃酮得率呈先升高后降低趨勢,當乙醇濃度為50%時,苦菜總黃酮得率達到最大值(3.11%)。 乙醇濃度在較低范圍內,隨著乙醇濃度的增加,苦菜細胞發生溶脹現象,細胞中黃酮類化合物溶出,苦菜總黃酮得率升高[18]；當乙醇濃度繼續增加,一方面,因為高濃度的乙醇在加熱過程中會揮發損失而影響提取效果,另一方面,根據相似相溶的原理,高濃度的乙醇溶液會溶解細胞中色素、脂溶性等物質,從而使得總黃酮得率降低[19-20]。 因此,選擇50%作為苦菜總黃酮提取的最佳乙醇濃度。

圖2 乙醇濃度對苦菜總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.2.2 浸提溫度對苦菜總黃酮得率的影響 由圖3可知,隨著浸提溫度的升高,苦菜總黃酮得率呈先升高后降低趨勢,當浸提溫度為70℃時,苦菜總黃酮的得率達到最大值(3.12%)。 這是因為適當提高溫度會加快分子運動,有利于苦菜黃酮的擴散和浸出,當溫度繼續升高時,黃酮分子結構遭到破壞,導致其提取率降低[21-22]。 故選用70℃作為苦菜總黃酮提取的最優浸提溫度。

圖3 浸提溫度對苦菜總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.2.3 浸提時間對苦菜總黃酮得率的影響 由圖4可知,當浸提時間為30 ～150 min 時,苦菜總黃酮得率呈上升趨勢,浸提時間為150 min 時,苦菜總黃酮得率達到最大值(3.18%),浸提時間大于150 min后其得率略有下降。 這可能是因為隨著浸提時間的延長,苦菜細胞壁逐漸被破壞,大量的黃酮類物質溶出,進而總黃酮得率升高[23]。 浸提時間達到150 min 時黃酮溶出已達到平衡,繼續延長浸提時間會使黃酮中一些熱敏性物質遭到破壞,且乙醇濃度隨著浸提時間的延長而降低,導致苦菜總黃酮得率下降[24]。 因此,選用150 min 作為苦菜總黃酮提取的最佳浸提時間。

2.2.4 料液比對苦菜總黃酮得率的影響 由圖5可知,不同的料液比下提取得到的苦菜總黃酮含量不同,當料液比為1 ∶60(m/v)時,苦菜總黃酮得率達到最大值(3.71%)。 這可能是由于料液比較低時,溶質和溶劑接觸不充分,導致細胞中的黃酮不易溶出[25]；而過大的料液比會降低超聲波的超聲效果,使苦菜細胞壁不易破壞,黃酮難以溶出,而且會造成原料的浪費[26]。 因此,選擇1 ∶60(m/v)作為苦菜總黃酮提取的最佳料液比。

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 試驗方案設計及結果 利用Design Expert 8.06 軟件里的Box-Behnken 設計試驗方案,其響應值及方差分析結果見表2、表3。

表2 響應面試驗設計與結果Table2 Design and results of response surface experiment

表3 響應面方差分析表Table3 Variance analysis of regression equation

圖5 料液比對苦菜總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

對表2數據進行分析,得到總黃酮得率(Y)和編碼自變量A、B、C、D的回歸方程：

Y=3.70-0.019A-0.041B+0.013C+0.13D-2.5×10-3AB+2.5×10-3AC+2.5×10-3AD+5×10-3BD+2.5×10-3CD-0.065A2-0.17B2-0.017C2-0.45D2。

由表3可知,該方程模型極顯著(P＜0.000 1),且失擬項不顯著(P＞0.05),說明所得方程擬合較好,回歸顯著[27]。 方程模型的校正相關系數R2=0.995 4,校正絕對系數=0.990 4,說明試驗因素A、B、C、D對苦菜總黃酮得率影響顯著。 其中B、D、A2、B2、D2的P值小于0.01,說明對苦菜總黃酮得率影響極顯著；試驗因素A的P值小于0.05,說明對苦菜總黃酮得率影響顯著。 根據回歸方程中各項系數的絕對值表示各因素對響應值影響的大小,正負表示對響應值影響的方向的原理[28],得到影響苦菜總黃酮得率的因素大小依次為：料液比(D)＞浸提溫度(B)＞乙醇濃度(A)＞浸提時間(C)。

2.3.2 浸提溫度與料液比交互作用對苦菜總黃酮得率的影響 在Design Expert 8.06 軟件中因素的交互作用顯著性是根據等高線的形狀來表現的[29]。 一般等高線為橢圓形,且密集陡峭,說明因素的交互作用顯著；等高線為圓形,且稀疏平滑,說明因素的交互作用不顯著[30]。 由圖6可知,浸提溫度與料液比的等高線圖陡峭,說明兩者之間的交互作用顯著,這與表3中結果一致,響應圖中存在最高點,說明苦菜總黃酮得率存在最大值[31]。

圖6 浸提溫度與料液比交互作用對苦菜總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio on the total flavonoids yield in Sonchus oleraceus

2.3.3 驗證試驗 響應面優化得到苦菜總黃酮的最優提取工藝條件為：乙醇濃度48.66%、浸提溫度68.82℃、 浸 提 時 間 162.05 min、 料 液 比1 ∶61.49(m/v),此條件下苦菜總黃酮得率的理論值為3.71%。為便于實際操作,將該條件調整為：乙醇濃度49%、浸提溫度69℃、浸提時間162 min、料液比1 ∶62(m/v),經驗證,此條件下苦菜總黃酮得率的實際值為3.73%±0.03%,與理論值誤差僅為0.54%,證明該試驗方程可靠、有效,可以用于模擬苦菜總黃酮提取工藝。

2.4 苦菜總黃酮的抗氧化活性分析

2.4.1 苦菜總黃酮提取液的Fe3+還原能力分析 由圖7可知,FeSO4濃度在0.01 ～0.10 mmol·L-1范圍內與吸光度值呈良好線性關系。 回歸方程為y=8.164 4x-0.004 2,相關系數R2=0.999 9。

由圖8可知,苦菜總黃酮提取液具有明顯的總抗氧化能力。 當苦菜總黃酮提取液質量濃度為0.005 ～0.020 mg·mL-1時,其Fe3+還原能力幾乎呈直線上升,當苦菜總黃酮提取液質量濃度大于0.02 mg·mL-1后,其Fe3+還原能力增大趨勢變緩。 根據總抗氧化標準曲線y=8.164 4x-0.004 2 可知,0.01 mg·mL-1苦菜總黃酮提取液的抗氧化能力等同于0.18 mmol·mL-1FeSO4溶液；與相同質量濃度的Vc 溶液相比,苦菜總黃酮提取液的Fe3+還原能力較低,這與向極釬等[32]的研究結果相似。

圖7 Fe3+還原力標準曲線Fig.7 The standard curve of Fe3+ reducing power

圖8 苦菜總黃酮提取液對Fe3+還原力的影響Fig.8 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on Fe3+ reducing power

2.4.2 苦菜總黃酮提取液的DPPH 自由基清除能力分析 由圖9可知,苦菜總黃酮提取液對清除DPPH自由基有明顯作用。 當苦菜黃酮提取液質量濃度為0.001～0.01 mg·mL-1時,其DPPH 自由基清除率幾乎呈直線上升；當苦菜黃酮提取液質量濃度為0.01 ～0.02 mg·mL-1時,其DPPH 自由基清除率上升趨勢變緩；當苦菜黃酮提取液質量濃度大于0.02 mg·mL-1時,其DPPH 自由基清除率幾乎保持不變,說明此時溶液中大多數DPPH 自由基已經被清除[33]。 與相同質量濃度的Vc 相比,質量濃度小于0.01 mg·mL-1時,苦菜黃酮提取液對DPPH 自由基表現出更強的清除能力；質量濃度大于0.01 mg·mL-1時,則Vc 對DPPH自由基表現出更強的清除能力,這與楊申明等[34]的研究結果相似。 根據擬合曲線可知,苦菜總黃酮提取液的半抑制濃度(IC50)為0.005 9 mg·mL-1。

圖9 苦菜總黃酮提取液對DPPH 自由基清除率的影響Fig.9 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on DPPH radical scavenging rate

2.4.3 苦菜黃酮提取液的羥基自由基清除能力分析 由圖10 可知,與相同質量濃度的Vc 相比,苦菜總黃酮提取液對羥基自由基的清除能力更強。 當苦菜總黃酮提取液的質量濃度為0.1 ～0.3 mg·mL-1時,其羥基自由基清除率上升迅速；當苦菜總黃酮提取液的質量濃度大于0.3 mg·mL-1時,其羥基自由基清除率上升變緩,說明此時溶液中的大多數羥基自由基已經被清除[35]。 根據擬合曲線得到苦菜總黃酮的IC50為0.153 mg·mL-1。

2.4.4 苦菜總黃酮提取液的超氧陰離子自由基清除能力分析 由圖11 可知,與相同質量濃度的Vc 相比,苦菜總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力較弱。 苦菜總黃酮提取液的質量濃度為0.005 ～0.03 mg·mL-1時,其對超氧陰自由基的清除率逐漸上升,表現出一定的清除能力,這與白生文等[36]的研究結果相似。 根據擬合曲線得到苦菜總黃酮的IC50為0.024 8 mg·mL-1。

圖10 苦菜總黃酮提取液對羥基自由基清除率的影響Fig.10 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on hydroxyl radical scavenging rate

圖11 苦菜總黃酮提取液對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.11 Effect of total flavonoids extract from Sonchus oleraceus on superoxide anion radical scavenging rate

3 討論

植物細胞壁是植物有效成分提取的主要阻礙,只有將封閉目標產物的細胞壁破壞掉,目標產物流出,才能提高有效成分的提取率[37]。 超聲波輔助提取技術因其操作簡便、經濟省時等優點已被廣泛應用于提取植物黃酮類物質。 夏寧等[38]采用水溶法提取荷葉總黃酮,通過優化得到荷葉總黃酮最佳得率為2.49%,而丁芳林等[39]采用超聲波輔助法提取荷葉總黃酮,通過正交優化得到荷葉總黃酮最佳提取率為4.4%。 本試驗結果表明,在優化后的工藝條件下,苦菜總黃酮理論得率為 3.71%,高于權美平[6]的試驗結果(1.96%),但比張晶晶等[19]的試驗結果(6.64%)低。以上除了工藝條件的差異,還可能與原料本身差異有關,不同地區的苦菜由于生長環境不同,導致其本身黃酮類物質含量不同[40],此外,原料顆粒的大小也影響總黃酮的提取效果。

研究表明,在人體正常代謝下自由基有一定的免疫和傳遞信號的功能,但過量的自由基會嚴重影響人的身體健康,引發多種疾病,如心臟病、老年癡呆癥等,因此降低自由基對人體危害已勢在必行[41]。 黃酮類物質具有清除自由基的能力,本試驗中,苦菜總黃酮提取液具備DPPH 自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力,其中苦菜總黃酮提取液對DPPH 自由基的清除能力與張坤等[42]的試驗結果相似,但表現出更強的DPPH 自由清除基能力,這可能是因為苦菜中含有較多的酚酸[2]；在清除羥基自由基能力上,本試驗結果與周勸娥等[43]的研究結果有差異,這可能是因為不同濃度的乙醇提取溶劑,導致苦菜總黃酮中成分的不同,且苦菜總黃酮提取液中含有單寧、多酚類等抗氧化物質,相互間產生協同效應,從而提高了對羥基自由基的清除能力；在清除超氧陰離子自由基能力上,與周勸娥等[43]的研究結果相比,本試驗中苦菜總黃酮提取液對超氧陰離子自由基表現出更強的清除能力。在總抗氧化能力(Fe3+還原力)上,本研究結果與張坤等[42]的試驗結果相似,說明苦菜總黃酮提取液表現出一定的總抗氧化能力。

4 結論

采用超聲波-乙醇法提取苦菜總黃酮,利用響應面法得到苦菜總黃酮的最優提取條件為：乙醇濃度49%、浸提溫度69℃、浸提時間162 min、料液比1 ∶62(m/v),此條件下苦菜總黃酮得率為3.73%±0.03%,較單因素得率有相應的提高,說明采用響應面法優化工藝可靠。 苦菜總黃酮提取液具有較強的抗氧化活性,在清除羥基自由基能力上,苦菜總黃酮較同質量濃度Vc 表現出更強的清除能力,這為苦菜總黃酮的開發和應用提供了科學依據。 但本試驗中苦菜總黃酮為粗提液,含有許多雜質,所以下一步可對苦菜總黃酮提取液進一步分離純化并對其成分進行分析,深入探究苦菜總黃酮的抗氧化功效。