復方龍脈寧磷脂復合物制備工藝及初步吸收評價

王景媛，史亞軍，黃維，王春龍

作者單位：陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046

冠心病主要是由冠狀動脈發生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟?。?］。復方龍脈寧方是陜西中醫藥大學第一附屬醫院腦病科陶根魚教授的經驗方，處方由葛根、川芎、穿山龍、蜂膠四味中藥組成，功能通絡活血，消炎化瘀，臨床應用于冠心病的治療。雖然復方龍脈寧提取物的活性成分有確切的藥理效應，但由于其水溶性、脂溶性均較差的特點造成了口服吸收較為困難，且藥物在體內的生物利用度不高，從而極大地限制了藥物的臨床使用［2］。相關研究證明，磷脂復合物作為一種新型給藥系統，用于中藥有效部位的改性時可有效提高有效部位的脂溶性和水溶性［3］。本研究自2017年12月至2018年4月將復方龍脈寧提取物的制備工藝與磷脂復合物技術相結合，通過評價改性前后提取物和磷脂復合物在十二指腸段的吸收情況，以論證此工藝能改善復方龍脈寧的生物藥劑學特性［4］，對復方龍脈寧的生物利用度的提高做出理論支持。

1 材料

梅特勒-托利多AR114電子天平；78-1型磁力攪拌器；Thermo Scientific Heraeus Labofuge400R臺式離心機；RE-3000旋轉蒸發器；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵。Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀。

SD大鼠由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供［合格證號：SYXK（陜）2017-014）］；葛根（批號20171226）、穿山龍（批號20171011）、川芎（批號20170907）均購自寶雞向源中藥飲片有限責任公司；蜂膠（陜西省咸陽市自然之子蜂產品公司，批號20170821）。葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110773-201612，純度≥98%）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業，批號040801，PC≥82%）；復方龍脈寧提取物、復方龍脈寧磷脂復合物、Krebs-Ringers腸營養液為均為自制；乙腈、甲醇為色譜純（美國Fisher）；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純（天津科密歐試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 復方龍脈寧磷脂復合物制備工藝

2.1.1復方龍脈寧提取物制備工藝［5］按原方比例取葛根，穿山龍，川芎三味藥材，用8倍量70%濃度的乙醇回流提取3次，每次2 h，提取完成后回收乙醇，提取液減壓濃縮至適量，采用大孔吸附樹脂法對提取液進行純化，樹脂型號為AB-8，提取液與樹脂比例為1 mL∶1 g，洗脫液為80%濃度乙醇，洗脫速度為0.5 BV/h，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮至適量后，按原方比例加入除蠟后的蜂膠，混勻，噴霧干燥，即得。

2.1.2磷脂復合物制備及評價［6］將“2.1.1”項下制得的復方龍脈寧提取物和一定量的磷脂置于圓底燒瓶中，加入一定量無水乙醇，將圓底燒瓶置于磁力攪拌器上進行恒溫攪拌，反應一段時間后，減壓回收無水乙醇，將圓底燒瓶內壁上的產物刮取下來，置于減壓干燥箱中干燥，得到復方龍脈寧磷脂復合物。

2.1.3復合率測定方法的建立［7］分別稱取已經研磨成細分的復方龍脈寧提取物1 g于50 mL三角瓶中，分別加入表1中的試劑20 mL，置于室溫（25℃）下，每5 min強力震蕩30 s，持續30 min，濾過，濾液用恒重后的蒸發皿收集，置于80℃水浴鍋上烘干后，轉移至烘箱烘干至恒重，試驗結果見表1。

溶解率＝（W1-W2）/W3×100%，W1＝蒸發皿+溶解物質量，W2＝蒸發皿質量，W3＝龍脈寧提取物質量。

從表1可得，復方龍脈寧提取物在甲苯中的溶解性較低，為0.7%，因此選擇甲苯作為測定復合率的溶劑。

利用龍脈寧提取物難溶于甲苯，而大豆卵磷脂和龍脈寧提取物磷脂復合物易溶于甲苯的特點［8］，將定量的龍脈寧提取物和大豆卵磷脂復合后，減壓除去反應溶劑，取出，研磨成細粉，精密稱定1 g龍脈寧提取物磷脂復合物，將復合物置于錐形瓶中，充分溶解其中的磷脂及磷脂復合物，以3 000 r/min的轉速離心10 min，取出，將上清液轉移至己恒重的蒸發皿中，除去甲苯，稱定其重量。復方龍脈寧提取物與大豆卵磷脂復合率（%）＝［M2-（M1-M2）×λ］/M1×100%（M1＝磷脂復合物質量，M2＝磷脂復合物溶于甲苯的質量，λ＝磷脂與藥物質量比）。依照此法檢驗三批樣品，計算各樣品復合率的平均值，從而計算出復方龍脈寧與大豆卵磷脂的復合率。

表1 復方龍脈寧提取物在不同溶劑中的溶解度

2.1.4單因素實驗 復合率的影響因素包括復合溶劑的類型、復合的時間與溫度、藥脂比以及藥物的濃度，由于提取物與磷脂的復合實質上是分子間的結合［9］，這就要求復方龍脈寧提取物在進行復合的溶劑中溶解度較高，結合預實驗結果，最終復合溶劑為無水乙醇，且復合率的影響因素為復合時間、藥物濃度以及藥脂比等，而復合溫度對復合效果的影響為低濃度時提取物與磷脂的復合率受反應溫度的影響較小，而高濃度時提取物與磷脂的復合率則受反應溫度影響較大，具體表現為溫度在40℃以上時復合率隨著溫度的增高而降低。

2.1.5正交實驗設計 根據單因素試驗的考察結果，選擇最佳反應溶劑為乙醇、反應溫度為40℃、高藥物濃度時，以藥物濃度（A）、藥脂比（B）和復合時間（C）做三因素三水平的正交實驗設計。采用L9（33）表，因素水平表見表2，結果見表3，4。

表2 因素水平表

表3 正交實驗結果

表4 方差分析表

由直觀分析可知，最佳工藝參數為A1B2C3，即藥物濃度為80 mg/mL，藥脂比為1∶3，反應時間為12 h，方差分析結果顯示藥脂比以及反應時間對結果無顯著性影響。按此優化條件制得3批復方龍脈寧磷脂復合物，測得磷脂復合物的平均復合率為86.72%。

2.2 復方龍脈寧磷脂復合物十二指腸吸收研究以葛根素為指標，使用HPLC進行測定，采用外翻腸囊法研究復方龍脈寧提取物改性前后在十二指腸的吸收變化，以評價復方龍脈寧提取物改性前后的改善情況。

2.2.1色譜條件 色譜柱為Hypersil ODSC18（250mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（25∶75），檢測波長為250nm，流速為1mL/min，理論板數按葛根素峰計算應不低于4 000。

2.2.2供試品溶液的配制 取葛根素對照品，用“2.2.1”項下流動相稀釋成濃度為0.051 2 mg/mL的葛根素溶液作為對照品儲備液。取過量復方龍脈寧提取物及磷脂復合物于錐形瓶中，加入Krebs-Ringers腸營養液，充分攪拌，得藥物飽和液，以3 000 r/min的速率離心10 min，取上清液，按照“2.2.1”項下色譜條件測定溶液中葛根素的含量，分別配置含量為0.1，0.5，1.0mg/mL的溶液作為供試品溶液。

2.2.3十二指腸吸收實驗 取受試SD大鼠禁食24 h，期間自由飲水，試驗時取10%水合氯醛將大鼠腹腔注射麻醉后，取出10 cm左右十二指腸，分離出腸系膜，用37℃Krebs-Ringers腸營養液將腸系膜沖洗干凈，翻轉十二指腸，結扎一端，固定另一端，加入Krebs-Ringers腸營養液飽和平衡5 min，將其放入“2.2.2”項下保持37℃恒溫的供試液中，保持氧及二氧化碳的供入，分別在0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3 h吸取0.2 mL腸囊內溶液，同時向腸囊內補充0.2mL Krebs-Ringers腸營養液，測定各時間點樣品中的葛根素含量。

2.2.4含量測定及數據處理 將各樣品置于離心機中，以3 000 r/min離心5 min，取上清液，按“2.2.1”項下色譜條件測定上清液中葛根素的含量，計算各樣品累計滲透量Q，以各樣品的Q測定值對時間進行零級、一級、Higuchi方程擬合，通過相關系數的計算確定數據處理模型。

上式中Q：單位面積的累積滲透量；V0：接收液體積（mL）；Cn：第n次取樣的藥物濃度；Vi：每次的取樣體積（mL）；Ci：第n-1次測得的藥物濃度）；A：離體十二指腸腸管吸收面積。

方法學試驗：分別精密吸取對照品儲備液4、8、10、12、16、20 μL進樣，以峰面積A對進樣量C（μg）進行回歸，得到回歸方程為A＝107x+106，R2＝0.999，結果表明，葛根素在0.2～1.02μg處線性關系良好。專屬性試驗顯示，葛根素峰分離良好，在空白樣品處沒有吸收，專屬性良好。精密度試驗顯示，連續進樣5次，葛根素峰面積RSD為0.96%；分別于0、2、8、12、24 h進樣，葛根素峰面積RSD為2.15%，儀器精密度良好，樣品在24h內穩定。對照品與供試品HPLC圖見圖1。

圖1 HPLC圖：A為葛根素對照品，B為復方龍脈寧提取物供試品

2.2.5樣品測定結果 對不同時間點兩種樣品的含量進行測定，將各樣品的累計滲透量對時間分別按照零級、一級、Higuchi進行擬合，結果表明以零級擬合最佳，這表明復方龍脈寧中的葛根素在十二指腸中表現出了被動擴散的吸收特征，不同濃度樣品測定結果見表5，將三個濃度條件下的累積吸收量對時間作圖，見圖2～4。

表5 不同濃度樣品測定結果（n＝5）

圖2 低濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

圖3 中濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

圖4 高濃度樣品吸收曲線（±s，n＝5）

結果表明，提取物的腸吸收累積量與樣品濃度呈現的正相關，吸收速度常數呈線性遞增，這表明復方龍脈寧中的葛根素為被動擴散吸收。復方龍脈寧提取物經與磷脂復合后，葛根素的腸吸收量明顯增加，高、中、低三個濃度提升量分別為65%、60%和26%。結果表明，將磷脂復合物技與復方龍脈寧提取物相結合，可明顯改善復方龍脈寧中葛根素的十二指腸吸收，這對提高復方龍脈寧的生物利用度提供了理論依據。

3 討論

復方龍脈寧方主治心腦血管疾病，在臨床應用廣泛，療效確切，本課題在前期研究中選擇了滴丸作為劑型，取得了一定的研究進展，但仍存在生物利用度低、用藥量大、用藥次數多等弊端。經過方中各味藥有效成分分析，發現含有大量的黃酮類及其他含羥基成分，文獻研究表明，這些物質與磷脂結合可改善其理化性質及生物利用度［10］，為了改善原方中的有效成分不利于吸收的缺點，本研究結合磷脂復合物技術［11］，對復方龍脈寧提取物進行處理，使其與磷脂復合，復合率較高，改善了藥物在體內的吸收，提高了藥物在體內的生物利用度。

據文獻報道，葛根素單體的磷脂復合物復合率可達100%［2］，但考慮到中藥復方成分的復雜性，以及提取物中含有其他不含羥基的化合物無法與大豆卵磷脂進行復合，86.72%的復合率已經是一個較為理想的結果。本試驗的復合溶劑為無水乙醇，并且對復合效果具有一定影響的復合時間、藥物濃度以及藥脂比等因素進行了考察，從而確定了復合工藝為藥物濃度為80 mg/mL，藥脂比為1∶3，反應時間為12h。

離體十二指腸吸收研究結果表明，磷脂復合物中葛根素的腸吸收情況相較原提取物顯著提高，吸收機制為被動擴散。但是，提取物與大豆卵磷脂復合后吸濕性增強，且給藥劑量、劑型選擇及藥物規格相應改變，后續將對這些問題進行研究。