大鼠血清25羥維生素D水平與年齡相關性白內障的關系

劉兵

作者單位：自貢市第四人民醫院眼科，四川 自貢 643000

年齡相關性白內障（age-related cataract，ARC）又稱老年性白內障，是一種與年齡密切相關的白內障疾?。?-2］。作為我國最常見的致盲性眼病，隨著全國人口平均壽命的延長，年齡相關性白內障的患病率也在逐年增加［3-4］。關于老年性白內障的預防及治療引起了越來越多學者的關注。25羥維生素D（25-OH-VD）是維生素D在體內的主要存在形式，作為人體中不可或缺的營養素之一，它不僅影響鈣磷的代謝，而且有廣泛的生理作用，是維持人體健康、細胞生長和發育的必不可少的物質［5-6］。血清中25羥維生素D的高低可以反映人體維生素D的儲存水平，與多種疾病密切相關［7-8］。關于血清25羥維生素D水平與年齡相關性白內障關系的報道較少，其作用機制目前也不清楚。因此，本研究自2017年2月至2018年2月通過注射補充維生素D的方式調節血清內25羥維生素D水平，觀察其對年齡相關性白內障的影響，并探討其可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物健康1月齡SPF級Wistar大鼠，體質量范圍為50～60 g，雌雄各半，購于北京維通利華有限責任公司，室溫、12 h∶12 h明暗交替喂養。動物合格證號：SCXK（京）2015-0001。本研究對大鼠的處置符合動物倫理學原則。

1.2 方法

1.2.1年齡相關性白內障大鼠模型構建 Wistar大鼠采用1%阿托品滴眼液進行散瞳處理后，采用隨機數字表法分為空白對照組、年齡相關性白內障模型組、維生素D低劑量組（維生素D1 250 IU/d）、維生素D高劑量組（維生素D2 500 IU/d），每組10只。

實驗開始前，對照組與模型組大鼠舌下靜脈注射10%葡萄糖溶液（5 mL/kg），維生素D對照組注射維生素D葡萄糖溶液。15 min后，除空白對照組外，其余三組均腹腔注射50%濃度的D-半乳糖生理鹽水注射液（劑量為25 g-1·kg-1·d-1），對照組注射等量的生理鹽水。連續注射3周并定期對大鼠進行散瞳處理，觀察晶狀體渾濁情況。

注：本研究的造模方法“大鼠舌下靜脈注射10%葡萄糖溶液（5 mL/kg），維生素D對照組注射維生素D葡萄糖溶液。15 min后，除空白對照組外，其余三組均腹腔注射50%濃度的D-半乳糖生理鹽水注射液（劑量為25 g-1·kg-1·d-1）”，其誘發白內障的原理是晶狀體前皮質和核的混濁，其與臨床的青光眼性白內障發病途徑比較接近。青光眼性白內障即為青光眼引起的白內障多由晶狀體前皮質和核開始，逐漸使晶狀體全混濁。以后水分吸收，囊膜增厚，晶狀體囊膜皺縮，并有鈣化等變化。其關鍵病因即為晶狀體的變化，故檢測眼壓以明確其癥狀的進展情況。

1.2.2眼壓及血清中25羥維生素D的檢測 采用眼壓計檢測大鼠眼壓，結果取3次平均值；采集外周血（眼底取血），EIA法測定血清中25羥維生素D的含量。

1.2.3晶狀體上皮細胞的分離培養 大鼠頸處死后取晶狀體上皮組織，生理鹽水沖洗后剪碎并加入胰蛋白酶（1.5 g/L）消化培養25 min（37℃、5%二氧化碳）；然后加入含有5%FBS的DMEM培養基，離心并用PBS洗滌，該過程重復3次。隨后調整細胞水平并接種于培養板上，細胞培養箱中傳代培養，2～3 d更換1次培養液。細胞傳代3次后收集細胞，以便后續檢測。

1.2.4聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法檢測DPPⅡ、cmycmRNA基因表達的變化 采用RT-PCR方法檢測DPPⅡ、c-mycmRNA基因表達水平。PCR擴增條件為：97℃預變性2.5 min，94℃變性30 s，60℃退火25 s，70℃延伸30 s，循環30次，最后72℃延伸60 s。取10 μL擴增產物和6 μL的DGL-200 Maker同時上樣，于2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像系統分析擴增結果并拍照。DPPⅡ、c-myc以及βactin引物設計，見表1。

1.2.5免疫印跡（Western Blot）分析相關蛋白表達水平變化 配置一定濃度的SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠并置于電泳槽上，分別取各組條件下的蛋白15μL上樣并電泳。電泳后轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉并用TBST清洗后分別加入稀釋過的蛋白抗體（1抗），4℃過夜，TBST清洗4次（每次5 min）；隨后加入HRP標記的2抗，37℃孵育2 h，TBST洗4次×5 min。設立陰性對照組，以GAPDH單克隆體為一抗，HRP標記的IgG為二抗。

1.3統計學方法本研究中數據全部采用SPSS 20.0統計分析軟件（美國IBM公司）進行處理；計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組基本情況白內障模型組、維生素D給藥組與空白對照組大鼠的基本情況見表1。由表1可知，對照組、模型組及各給藥組之間大鼠體質量、收縮壓及舒張壓均差異無統計學意義（P＞0.05）且均在正常范圍內，見表2。

表1 PCR過程中引物序列設計

表2 白內障模型組、給藥組與對照組大鼠基本情況/±s

表2 白內障模型組、給藥組與對照組大鼠基本情況/±s

組別空白對照組白內障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10體質量/g 54.62±7.65 54.49±8.54 55.85±8.72 56.42±4.55 1.346 0.412收縮壓/mmHg 121.32±6.05 120.49±6.54 120.85±5.72 120.35±6.25 1.287 0.399舒張壓/mmHg 77.62±5.25 78.43±4.94 78.62±5.37 78.30±5.20 1.453 0.428

2.2 25羥維生素D水平與年齡相關性白內障大鼠眼壓的關系與空白對照組相比，白內障模型組25羥維生素D水平降低，眼壓升高；維生素D給藥后，維生素D水平較模型組升高，眼壓降低，差異有統計學意義（25羥維生素D水平：F＝9.215，P＝0.007；眼壓：F＝12.502，P＝0.005），且以高劑量給藥組效果最明顯，且隨著維生素D水平的升高，大鼠眼壓逐漸降低，見表3。

2.3 25羥維生素D水平與白內障大鼠晶狀體渾濁情況的關系裂隙燈顯微鏡觀察可知，空白對照組大鼠始終保持晶狀體透明；注射3周后，白內障模型組中2只晶狀體高度渾濁（3級），8只晶狀體呈肉眼可見的渾濁（4級）。姜黃素低劑量給藥后，4只大鼠晶狀體呈3級渾濁，6只大鼠晶狀體呈4級渾濁；高劑量給藥后，分別有2只、4只、6只大鼠呈現2級、3級和4級渾濁。綜合分析25羥維生素D水平與白內障大鼠晶狀體渾濁情況可知，血清中維生素D水平越低，晶狀體渾濁程度越嚴重；給藥后，血清中維生素D水平有一定程度的恢復，晶狀體渾濁程度降低，差異有統計學意義（F＝11.635，P＝0.003），見表4。

表3 25羥維生素D水平與年齡相關性白內障大鼠眼壓的關系/xˉ± s

2.4 25羥維生素D水平對晶狀體上皮細胞LEC凋亡的影響各組LEC細胞凋亡率均隨時間延長而緩慢增加；白內障模型組晶體上皮細胞凋亡率高于空白對照組，差異有統計學意義（F＝8.212，P＝0.016）；與模型組相比，給藥組各時間段的LEC細胞凋亡率下降，且以高劑量組降低效果最明顯。綜合分析25羥維生素D水平與LEC細胞凋亡率可知，血清中維生素D水平越低，LEC細胞凋亡率越高；給藥后，血清中維生素D水平有一定程度的回升，LED凋亡程度降低，差異有統計學意義（1周：F＝10.258，P＝0.0111；2周：F＝13.390，P＝0.005；4周：F＝14.157，P＝0.003），見表5。

2.5 血清中25羥維生素D水平對年齡相關性白內障大鼠晶狀體上皮細胞DPPⅡ、c-myc基因表達水平的影響與對照組相比，白內障模型組大鼠晶狀體上皮細胞DPPⅡ、c-myc基因表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。給藥后，隨著血清中25羥維生素D水平的回升，DPPⅡ、c-myc表達的降低，且血清中維生素D水平較高時降低效果更為明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，血清中25羥維生素D可有效抑制DPPⅡ、c-myc基因的表達，從而達到減緩并抑制白內障的發病，見表6，圖1。

表5 25羥維生素D水平對晶狀體上皮細胞LEC凋亡的影響/±s

表5 25羥維生素D水平對晶狀體上皮細胞LEC凋亡的影響/±s

組別空白對照組白內障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 25羥維生素D水平/（ng/mL）21.53±4.25 19.20±2.63 26.46±3.51 35.32±4.52 8.212 0.016 LEC細胞凋亡率/%1周3.42±1.93 12.60±2.26 8.86±2.34 6.07±3.13 10.258 0.011 2周4.35±1.06 18.23±3.06 10.24±2.87 8.23±2.06 13.390 0.005 4周6.52±1.76 25.72±4.24 13.52±3.40 10.72±2.24 14.157 0.003

表6 血清中25羥維生素D水平對DPPⅡ、c-myc基因表達水平的影響/（ng/mL，±s）

表6 血清中25羥維生素D水平對DPPⅡ、c-myc基因表達水平的影響/（ng/mL，±s）

組別空白對照組白內障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 DPPⅡ（灰度值）1.31±0.06 4.18±0.21 2.31±0.72 2.03±0.40 11.217 0.008 c-myc（灰度值）1.02±0.05 3.89±0.31 2.25±0.62 1.91±0.41 13.087 0.005

圖1 RT-PCR檢測DPPⅡ、c-myc基因表達情況

2.6 血清中25羥維生素D水平對年齡相關性白內障大鼠晶狀體上皮細胞TNF-α、IL-8蛋白表達水平的影響與對照組相比，模型組大鼠晶狀體上皮細胞TNF-α、IL-8蛋表達水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。給藥組與模型組相比，隨著血清中25羥維生素D水平回升，均有下調TNF-α、IL-8表達的效果，差異有統計學意義（P＜0.05），且血清中維生素D水平較高時降低效果更明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果表明，血清中25羥維生素D可有效抑制TNF-α、IL-8基因的表達，從而達到減緩并抑制白內障的發病，見表7，圖2。

表7 NE及BOD對感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表達水平的影響/±s

表7 NE及BOD對感染性休克大鼠TNF-α、IL-8蛋白表達水平的影響/±s

指標空白對照組白內障模型組維生素D低劑量組維生素D高劑量組F值P值鼠數10 10 10 10 TNF-α（灰度值）1.25±0.04 5.28±0.21 3.48±0.61 2.63±0.31 12.023 0.002 IL-8（灰度值）1.12±0.08 4.63±0.50 2.59±0.71 2.14±0.30 10.419 0.005

圖2 Western Blot檢測TNF-α、IL-8蛋白表達情況

3 討論

年齡相關性白內障是一種與年齡相關的致盲率較高的晶狀體渾濁性疾?。?-10］。隨著年齡的增長，晶狀體中變性蛋白質和脂質不斷累積，在多種因素的綜合作用下導致白內障疾病的產生［11-12］，其公認的治療手段為手術治療，但早期白內障術后療效不佳，部分病人不適于手術，因此預防就顯得尤為重要。

DPPⅡ（二肽基肽酶Ⅱ）作為一種細胞內溶酶體蛋白酶，廣泛存在于晶狀體中，與年齡相關性白內障的發病密切相關［13］。c-myc基因是原癌基因家族的重要成員，與晶狀體上皮細胞的增殖、分化和凋亡密切相關，它的過度表達可促進白內障的發生［14-15］。TNF-α由LPS刺激過量產生，可通過刺激內皮細胞及誘導炎癥因子的產生導致炎癥及組織損傷，在炎癥反應中有重要作用［16-17］。IL-8是趨化因子家族的一員，有多重免疫調節功能，在囊性纖維化發病過程中起重要作用［18-20］。

本研究發現，白內障模型組大鼠血清中25羥維生素D水平降低，眼壓較高；給藥后血清中維生素D水平上升，眼壓降低，即D-半乳糖誘導后，血清中25羥維生素D水平與眼壓負相關。而且，隨著血清中維生素D水平升高，可降低D-半乳糖誘導年齡相關性白內障的嚴重程度，誘導建模后血清中25羥維生素D水平與晶體渾濁情況負相關。血清中維生素D水平越低，LEC細胞凋亡率越高；給藥后，血清中維生素D水平有較大程度的升高，LED凋亡程度降低，即誘導建模后血清中25羥維生素D水平與晶狀體上皮細胞LEC凋亡呈負相關。此外，血清中25羥維生素D可抑制DPPⅡ、c-myc的表達，下調TNF-α、IL-8水平，且高劑量給藥組抑制作用最強。血清中25羥維生素D可下調溶酶體蛋白酶DPPⅡ、原癌基因c-myc、癌細胞死亡因子TNF-α、炎癥因子IL-8的表達，保護晶狀體上皮細胞，延緩其凋亡，從而達到延緩年齡相關性白內障發生發展的作用。本研究結果表明，血清中25羥維生素水平與年齡相關性白內障的發生發展呈負相關，這可能與其下調DPPⅡ、cmyc、TNF-α、IL-8的表達有關。但是其具體的作用機制還需要進一步的探討和研究。本研究提示，提高血清中25羥維生素D水平對年齡相關性白內障的預防及治療有十分重要的意義，同時也為維生素D作為年齡相關性白內障病人保健藥品的臨床應用提供理論支持。

綜上所述，血清中25羥維生素D水平與年齡相關性白內障的發展負相關，這對于白內障的預防及治療有十分重要的意義。