超聲引導下細針穿刺細胞學檢查聯合BRAFV600E檢測與甲狀腺乳頭狀癌侵襲性病理特征的相關性

張 穎，羅渝昆，張 艷，張明博，廣 旸，謝 芳，姜 波，唐 杰

1南開大學醫學院，天津 3000712中國人民解放軍總醫院第一醫學中心超聲科，北京 100853

近年來，由于精準診斷技術如高頻超聲的不斷發展以及環境因素的影響，甲狀腺癌的發病率與檢出率在全球范圍內出現增長，目前已成為近年來發病率增長最快的惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)是甲狀腺癌最常見的病理學類型，占所有甲狀腺癌的85%～90%[1]。大多數PTC具有惰性生物學特征，但仍有部分PTC出現淋巴結轉移或包膜外侵犯等侵襲性病理特征，進而改變臨床分期，影響預后[1-2]。細針穿刺細胞學檢查(fine-needle aspiration，FNA)被視為超聲發現的甲狀腺可疑結節最準確的診斷方法，具有風險小、準確性高等諸多優點，在指南中推薦，并在臨床中廣泛應用[2]。甲狀腺細胞病理學Bethesda報告系統(Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology，BSRTC)是FNA結果的規范解讀，89%～95%的FNA可以得到滿意的解讀，并指導臨床治療[3]。但仍有近40%的FNA結果是不確定的，使得臨床難以決定手術治療方案，可能導致不必要的外科干預，增加醫療成本及風險[3]。BRAFV600E突變是PTC中最重要的基因突變，其突變率可高達28%～90%，特異性幾乎達100%，但BRAFV600E基因突變頻率在不同文獻報道中差別較大，關于其突變能否提示PTC侵襲性的說法不一[4-7]。因此，本研究旨在探討超聲引導下FNA、BRAFV600E基因突變檢測及兩者聯合與PTC臨床病理特征的相關性，以期在FNA結果不確定時，指導臨床治療方案。

對象和方法

對象 選取2016年4月至2017年7月超聲提示甲狀腺可疑惡性結節，行超聲引導下FNA及BRAFV600E基因突變檢測，最終經手術病理證實為PTC的患者。其中在術前超聲檢查及術中探查均未發現異常淋巴結者，依據癌灶位置行預防性中央區淋巴結清掃或不清掃；在術前超聲發現異常淋巴結或在術中觸及腫大淋巴結者，依據異常淋巴結位置行中央區淋巴結清掃及選擇性或預防性頸側區淋巴結清掃。納入標準：(1)行甲狀腺切除術并經手術病理證實為PTC；(2)術前均經過超聲、FNA檢查及BRAFV600E基因突變檢測。排除標準：(1)拒絕手術或未于中國人民解放軍總醫院行甲狀腺切除術的患者；(2)手術病理不明確或為良性病變、除PTC之外的其他惡性病變；(3)甲狀腺腫瘤復發或2次手術的患者。最終263例患者共263個結節(多發癌灶選擇較大者)納入本研究。檢查前均獲得患者本人知情同意并簽署知情同意書。

超聲引導下FNA 采用百勝MyLabTM Twice超聲診斷儀，L 5-12 MHz高頻探頭?；颊呷⊙雠P位，頸部墊枕，頭向后仰充分暴露頸前區，彩色多普勒超聲選定擬穿刺結節，常規消毒后，以23G或25G針在彩超引導下，針尖進至可疑結節中心，在無負壓情況下針尖在結節內不同部位來回提插10～15次，將穿刺所得樣本立即涂片并置于95%酒精中固定，同時將穿刺針置于盛有180 μl細胞裂解液的1.5 ml EP 管中沖洗，以備BRAFV600E檢測。

FNA病理判讀 由經驗豐富的病理科醫師依照BSRTC結果分為Ⅰ～Ⅵ類，Ⅰ類：標本不能診斷或不滿意；Ⅱ類：良性病變；Ⅲ類：意義不明確的細胞非典型病變或濾泡性病變；Ⅳ類：濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類：可疑惡性腫瘤；Ⅵ類：惡性腫瘤[3]。

BRAFV600E基因檢測 應用廈門艾德公司生產的人類BRAF基因V600E突變熒光PCR檢測試劑盒，完全按照其說明書進行檢測。將每例患者穿刺針的沖洗液使用DNA提取試劑盒法提取，利用實時熒光定量PCR法擴增。BRAFV600E突變檢測結果判斷：待測樣品的內控HEX(或VIC)信號應升起；如待測樣本外控FAM信號的每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數(cycle threshold，Ct)≥28，則樣本為陰性(野生型)，如樣本的FAM信號Ct值<28，則樣本為陽性(突變型)。

患者病變分期 采用美國癌癥聯合會TNM分期方案中的各項描述進行[8]。

結 果

BRAFV600E基因突變與PTC臨床病理特征的關系 共納入263例患者，其中男性55例、女性208例，平均年齡(43.4±10.7)歲，45歲以下患者130例、45歲及以上患者133例。263例PTC中，最大徑≤1 cm者[甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)]168例，最大徑>1 cm者(非PTMC)95例。

263例PTC中，FNA診斷敏感度為86.3%(227/263)；BRAFV600E基因突變率為85.9%(226/263)，其中PTMC突變率為91.1%(153/168)，非PTMC突變率為76.8%(73/95)。共225例患者進行淋巴結清掃，淋巴結轉移率為35.6%(80/225)，其中PTMC轉移率為23.8%(34/143)，非PTMC轉移率為56.1%(46/82)；包膜外侵犯的患者占9.9%(26/263)。

依照TNM分期，T1 222例(84.4%)、T2 11例(4.2%)、T3 30例(11.4%)。NX(未行淋巴結清掃，淋巴結轉移情況不明)38例(14.4%)、N0 145例(55.1%)、N1a 46例(17.5%)、N1b 34例(12.9%)。所有患者癌灶未侵及皮下軟組織、喉、氣管、食管或喉返神經，均無遠處轉移。Ⅰ期225例(85.6%)、Ⅱ期1例(0.4%)、Ⅲ期26例(9.9%)、ⅣA期11例(4.2%)。

每項臨床特征分為兩組進行BRAFV600E突變率的比較，其中FNA病理結果分為標本不能診斷或不滿意、良性病變、意義不明確的細胞非典型病變或濾泡性病變(不明確診斷)與可疑惡性腫瘤、惡性腫瘤(明確診斷)兩組；腫瘤大小分為最大徑≤1 cm(微小癌)與最大徑>1 cm(非微小癌)兩組；包膜侵犯情況分為無甲狀腺外侵犯與甲狀腺外侵犯兩組；原發腫瘤T分期分為TI與T2～T3兩組；淋巴結轉移情況分為無轉移(N0)與有轉移(N1a/N1b)兩組；臨床分期分為Ⅰ期與Ⅱ～ⅣA期兩組。BRAFV600E基因突變與年齡(<45 歲/≥45 歲，81.5% 比 90.2%，χ2=4.104，P=0.043)、FNA病理結果(無法診斷、良性、病理不明確/可疑惡性、惡性，72.2% 比88.1%，χ2=6.484，P=0.011)、是否為微小癌(≤1 cm/>1 cm，91.1% 比76.8%，χ2=10.164，P=0.001)、原發腫瘤T分期(T1/T2～T3，87.8% 比75.6%，χ2=4.281，P=0.039)有關，其中年齡≥45 歲、FNA診斷為惡性或可疑惡性、腫瘤最大徑≤1 cm(微小癌)、原發腫瘤分期為T1者BRAFV600E突變率更高。而BRAFV600E突變與性別(男/女，85.5% 比 86.1%，χ2=0.013，P=0.909)、甲狀腺包膜外侵犯(無甲狀腺外侵犯/甲狀腺外侵犯，86.1% 比 84.6%，χ2=0.000，P=1.000)、淋巴結轉移(無區域淋巴結轉移/有區域淋巴結轉移，86.9% 比 78.8%，χ2=2.546，P=0.111)、腫瘤臨床分期(Ⅰ期/Ⅱ期～Ⅳa期，86.7% 比81.6%，χ2=0.696，P=0.404)無關。

FNA病理結果與PTC臨床病理特征的關系 單因素分析顯示FNA診斷敏感度在不同年齡、性別、腫瘤大小、是否有甲狀腺包膜外侵犯、原發腫瘤T分期、是否淋巴結轉移、臨床分期中差異均無統計學意義(表1)。以FNA病理結果(不明確診斷/明確診斷)為因變量，年齡是否>45歲、性別、腫瘤最大徑是否≥1 cm、是否有甲狀腺包膜外侵犯、是否淋巴結轉移作為自變量，進行多因素分析，結果顯示差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表1 FNA病理結果與PTC臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between FNA pathological findings and PTC clinicopathological characteristics

FNA：細針穿刺細胞學檢查；PTC：甲狀腺乳頭狀癌；ND/UNS：標本無法診斷或不滿意；AUS/FLUS：意義不明的細胞非典型性病變或濾泡性病變；SM：可疑惡性腫瘤；淋巴結未清掃的病例不參與淋巴結是否轉移中診斷率的比較；a：采用連續校正χ2值

FNA：fine-needle aspiration；PTC：papillary thyroid cancer；ND/UNS：nondiagnostic or unsatisfactory；AUS/FLUS：atypical cells of undetermined significance/ follicular lesions of undetermined significance；SM：suspicious for malignancy；patients without lymph node dissection did not participate in the comparison of the diagnostic rates in lymph node metastasis；a：continuous correction ofχ2is used

超聲引導下FNA聯合BRAFV600E基因突變檢測與PTC侵襲性的關系 為明確當FNA明確診斷且BRAFV600E基因突變時，是否應當采取更積極的治療策略，將患者分為FNA與BRAFV600E雙陽性及非雙陽性患者進行比較，即以下兩組：FNA病理結果為Ⅴ、Ⅵ類且BRAFV600E為突變型的患者，及所有FNA病理結果為Ⅰ～Ⅲ類或BRAFV600E為野生型的患者。單因素分析顯示，兩組在不同臨床病理特征(腫瘤最大徑是否≥1 cm、是否有甲狀腺包膜外侵犯、原發腫瘤T分期、是否有淋巴結轉移、臨床分期)中差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。以超聲引導下FNA聯合BRAFV600E基因突變檢測結果為因變量，腫瘤最大徑是否≥1 cm、是否有甲狀腺包膜外侵犯、是否淋巴結轉移作為自變量，進行多因素分析，結果顯示差異均無統計學意義(P>0.05)(表4)。

討 論

相關研究顯示，甲狀腺癌近年在全球范圍內發病率持續增長，但死亡率沒有明顯上升，且增長的甲狀腺癌主要是PTMC[1]。伴隨著大樣本長期隨訪研究的進行，目前認為大多數PTC，尤其是PTMC預后良好，一項包含18 445例PTMC患者的研究顯示，其20年生存率可達95%，疾病特異性死亡率僅0.5%[9]。然而，仍有20%～30%的甲狀腺癌因甲狀腺外侵犯、淋巴結轉移等高侵襲性表現影響預后[1]。因此，對甲狀腺癌進行危險分層，明確哪些可以積極隨訪觀察、哪些必須及時手術治療，以及進行何種術式治療尤為重要。

表2 FNA病理結果影響因素的Logistic回歸分析結果Table 2 Logistic regression analysis of influencing factors of FNA pathological results

表3 超聲引導下FNA聯合BRAFV600E基因突變檢測與PTC臨床病理特征的關系Table 3 Ultrasound-guided FNA combined with BRAFV600E gene mutation detection and its relationship with PTC clinicopathological characteristics

淋巴結未清掃的病例不參與淋巴結是否轉移中病理結果的比較

Patients without lymph node dissection did not participate in the comparison of pathological results in lymph node metastasis

表4 超聲引導下FNA聯合BRAFV600E基因突變檢測的Logistic回歸分析結果Table 4 Logistic regression analysis of ultrasound-guided FNA combined with BRAFV600E mutation detection

FNA是目前術前診斷甲狀腺結節最可靠的方法，但仍有近40%的FNA結果是不確定的，使得臨床難以決定治療方案[3，10]。為了提高FNA的診斷價值，近年分子基因檢測已成為研究熱點，其中BRAFV600E突變在PTC中最為常見，其突變率可高達28%～90%[7]。有研究認為當FNA病理結果更明確時可提示PTC高侵襲性[4]，而BRAFV600E在判斷PTC侵襲性中的價值近年一直存在爭議[4-7]。本研究通過結合FNA結果及BRAFV600E突變情況，與手術病理及臨床分期相對照，探討超聲引導下FNA聯合BRAFV600E檢測與PTC侵襲性病理特征的相關性，為臨床治療提供參考依據。

本研究共納入263例手術病理證實為PTC的患者，仍有36例術前FNA病理不明確，FNA診斷敏感度為86.3%，與相關研究結果[11]相近。對比分析FNA診斷為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類及Ⅴ、Ⅵ類的PTC，兩組患者在不同年齡分組、性別、腫瘤大小、是否有甲狀腺包膜外侵犯、原發腫瘤T分期、是否淋巴結轉移以及臨床分期中差異均無統計學意義。Vanderlaan等[5]認為患者的性別、年齡、腫瘤是否多發與FNA診斷明確與否無關，但FNA診斷為Ⅵ類的PTC傾向于更高的臨床分期，Ⅲ類時則多數最終證實為濾泡亞型PTC，表現為更低的侵襲性。然而，本研究FNA最初診斷為Ⅲ類的PTC中，有1例為彌漫硬化型PTC，為高侵襲性亞型，術前已發生明顯的淋巴結轉移，FNA診斷不明確的原因可能是穿刺時無法對癌灶進行準確定位。此外，36例FNA結果不明確的PTC中，PTMC占77.8%(28/36)，在剩余的8例非PTMC中，除1例彌漫硬化型PTC外，4例伴橋本氏甲狀腺炎，1例伴周圍腺體腺瘤樣增生，因此，穿刺標本不足或受到周圍腺體良性病變的影響可能是導致FNA結果不明確的原因，并非因侵襲性低所致。

本研究BRAFV600E基因突變與年齡、是否為微小癌、原發腫瘤T分期有關，而與性別、甲狀腺包膜外侵犯、淋巴結轉移、腫瘤臨床分期無關。其中年齡≥45 歲、腫瘤最大徑≤1 cm(微小癌)、原發腫瘤分期為T1者BRAFV600E突變率更高。這一結果與Trovisco等[6]的研究結果相似。Trovisco等[6]通過分析來自7所醫院的多中心數據，得出BRAFV600E與PTC大小、血管侵犯、甲狀腺外侵犯、淋巴結轉移等高侵襲性特征無關，而與年齡有關，年齡大者BRAFV600E突變率更高。在年老的人群中BRAFV600E突變率更高，可能是帶有BRAFV600E突變的PTC更容易出現在年老的人群中，或者是在同等年齡的人群中，帶有BRAFV600E突變的PTC進展更慢。而后一種假設表明BRAFV600E突變并不意味高侵襲性，反而可能相對于其他類型的基因突變使PTC表現得更為惰性，而這一假設也可以解釋本研究的結果。腫瘤最大徑≤1 cm、原發腫瘤分期為T1均為低侵襲性指標，并且本研究2例彌漫硬化型PTC及1例低分化PTC均未見BRAFV600E突變。本研究PTMC占63.9%(168/263)，BRAFV600E在PTMC中的突變率(91.1%)顯著高于非PTMC(76.8%)(P=0.001)，造成整體BRAFV600E突變率升高，研究對象的不同也可能是導致與一些研究結論[12]相反的原因。由于PTC相對良好的臨床預后與BRAFV600E基因的高突變率，不良事件的發生與BRAFV600E突變之間缺乏相關性是合乎邏輯的[13]。此外，在進展迅速的兒童PTC、彌漫硬化型PTC等高危亞型中罕有BRAFV600E突變也可說明這一結論[14]。

有研究指出，明確的FNA結果與BRAFV600E突變同時存在可以預測PTC更高的侵襲性與臨床分期[4]。為明確當FNA明確診斷且BRAFV600E基因突變時，是否應當采取更積極的治療策略，本研究進一步將FNA與BRAFV600E雙陽性及非雙陽性患者進行比較，結果證實兩組患者在不同臨床及病理特征下差異無統計學意義。因此，不論是FNA明確診斷為惡性，還是BRAFV600E存在突變，都不應是擴大甲狀腺切除范圍或者對臨床淋巴結轉移陰性的患者進行預防性中央區淋巴結清掃的指征。在今后的研究中，應找尋除BRAFV600E外更適于評價PTC侵襲性的分子診斷指標，建立更加有效的甲狀腺癌風險分層體系。

綜上，FNA病理結果及BRAFV600E基因突變檢測與PTC的侵襲性病理特征無相關性，雙陽性的結果與更高侵襲性病理特征也無相關性。由于BRAFV600E在低侵襲性PTMC中的高突變率，其在評估PTC侵襲性中的價值受限。