密蒙花顆粒劑對去勢雄兔淚腺組織細胞Caspase-1和IL-18的影響

李翔 覃艮艷 彭俊 歐陽云 蔣鵬飛 彭清華

〔摘要〕 目的 觀察密蒙花顆粒劑對去勢雄兔淚腺組織細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine aspartic protease-1，Caspase-1）和白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）表達的影響。方法 將30只新西蘭長耳白兔隨機分為5組，分別為空白組（不灌胃）、模型組（不灌胃）、密蒙花顆粒劑組（灌胃藥物為密蒙花顆粒劑）、安慰劑組（灌胃藥物為生理鹽水）、睪酮組（在兔大腿肌肉處注射丙酸睪酮注射液）。除空白組外，所有兔子的造模方式均為雙側睪丸及附睪切除術。干預30 d后，將所有兔子處死，摘取淚腺組織進行免疫組化染色觀察淚腺組織細胞結構并檢測淚腺組織中Caspase-1和IL-18的表達。結果 免疫組化染色顯示：模型組兔子淚腺組織排列不整齊，細胞破碎;密蒙花顆粒劑組與睪酮組兔子淚腺組織排列整齊，細胞結構清晰。與空白組相比，模型組Caspase-1、IL-18平均光密度差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，安慰劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統計學意義（P>0.05）;密蒙花顆粒劑組與睪酮組Caspase-1、IL-18平均光密度值降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與睪酮組相比，密蒙花顆粒劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統計學意義（P>0.05）。結論 密蒙花顆粒劑對去勢雄兔淚腺細胞Caspase-1、IL-18表達具有抑制作用，密蒙花顆粒劑可能通過抑制淚腺組織中Caspase-1、IL-18的表達，減少淚腺組織細胞的焦亡，從而達到治療干眼的目的。

〔關鍵詞〕 密蒙花顆粒劑;去勢雄兔;淚腺組織;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1;白細胞介素-18

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ?; 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.004

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Mimenghua Granules on the expression of cysteine aspartic protease-1 （Caspase-1） and interleukin-18 （IL-18） in cells from lacrimal gland tissue of castrated male rabbits. Methods A total of 30 New Zealand long-eared white rabbits were randomly divided into 5 groups： a blank group （no gavage）， a model group （no gavage）， Mimenghua Granules group （Mimenghua Granules as the gavage drugs）， a placebo group （saline as the gavage drugs）， a testosterone group （testosterone propionate injection was injected into the rabbit thigh muscle）. Except for the blank group， all rabbits were subjected to bilateral testicular and epididymal resection for molding. After 30 days of intervention， all rabbits were sacrificed， and lacrimal gland tissue was harvested for immunohistochemical staining to observe the structure of lacrimal gland tissue. And the expression of 2 pyroptosis factors of Caspase-1 and IL-18 in lacrimal gland tissue was detected. Results Immunohistochemistry staining showed that the lacrimal gland tissue of the model group was not arranged neatly and the cells were broken; the lacrimal gland tissue of the Mimenghua Granules group and the testosterone group were arranged neatly and the cell structure was clear. Compared with the blank group， the difference of average optical density of Caspase-1 and IL-18 in the model group was statistically significant （P<0.05）. Compared with the model group， there was no statistically significant difference in the average optical of Caspase-1 and IL-18 in the placebo group （P>0.05）; while the differences in average optical density of Caspase-1 and IL-18 in the Mimenghua Granules group and the testosterone group were statistically significant （P<0.05）. Compared with the testosterone group， the difference of average optical density of Caspase-1 and IL-18 in the Mimenghua Granules group was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion Mimenghua Granules has an inhibitory effect on the expression of Caspase-1 and IL-18 in castrated male rabbits' lacrimal gland cells. Mimenghua Granules may reduce the pyroptosis of lacrimal gland tissue through inhibiting the expression of Caspase-1 and IL-18 in lacrimal gland tissue to achieve the purpose of treating dry eyes.

〔Keywords〕 Mimenghua Granules; castrated male rabbits; lacrimal gland tissue; Caspase-1; IL-18

淚膜與眼表協會（tear film and ocular surface society，TFOS）在干眼病國際專家共識第二版（dry eye workshop Ⅱ， DWESⅡ）中對干眼進行了重新定義，干眼不僅是淚液和眼球表面的多因素疾病，還可引起主觀不適、視覺障礙和淚膜不穩定等多種癥狀[1]。干眼全球平均發病率為14%～33%，其發病率有逐年增高的趨勢[2-3]。因此受到醫學領域的廣泛關注，成為眼科的研究熱點。干眼的發病機制有多種，本課題組前期研究發現干眼的發生與雄激素水平降低有關，對雄兔進行去勢干預后可造成干眼模型[4]，此外，干眼還與免疫、炎性反應、淚腺細胞程序化死亡等因素關系密切，而淚腺細胞的程序化死亡在干眼的發病機制中起著至關重要作用[5-6]。焦亡是細胞程序化死亡方式的一種，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine aspartic protease-1，Caspase-1）和白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）是細胞焦亡因子信號通路的關鍵細胞因子。本研究以去勢雄兔為研究對象，通過觀察密蒙花顆粒劑對去勢雄兔淚腺組織結構及焦亡相關蛋白Caspase-1、IL-18表達的影響，探討其治療干眼的部分作用機制。

1 實驗材料

1.1 ?實驗動物

健康成年新西蘭長耳白兔（雄性）30只，體質量 為1.5～2.0 kg（湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物質量合格證號：SCXK（湘）2009-0012）。飼養在湖南中醫藥大學實驗樓動物實驗中心，自由進食進水。

1.2 ?主要儀器

裂隙燈顯微鏡、手持式直接檢眼鏡，均購自蘇州六六視覺科技股份有限公司;Leica石蠟切片機（德國徠卡公司）;顯微攝像機（上海萬衡精密光學儀器廠）;Image Pro Plus 6.0計算機圖像分析系統。以上實驗所用相關器材均由湖南中醫藥大學組織形態學實驗室和眼科實驗室提供。

1.3 ?主要藥品與試劑

密蒙花顆粒劑（按密蒙花∶枸杞∶菊花=1∶1∶1質量比組成，湖南中醫藥大學藥學院藥物制劑教研室按現代制劑工藝制備）;丙酸睪酮注射液（天津金耀藥業有限公司，批號：1507111，規格：1 mL∶25 mg）;注射用青霉素鈉（廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號：170943，規格：40萬單位）;氯化鈉注射液（江蘇亞邦生緣藥業有限公司，批號：18111304，規格：500 mL∶4.5 g）;滅菌注射用水（上海長征富民金山制藥有限公司，批號：201809180，規格：500 mL）;Harris蘇木素（湖南中醫藥大學病理實驗室，批號：E607317）;兔抗兔Caspase-1單克隆抗體（規格：200 μg/mL）、兔抗兔IL-18單克隆抗體（規格：200 μg/mL）、免疫組織化學試劑盒、3，3-二氨基聯苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）顯色劑，均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2 方法

2.1 ?分組及造模

將30只成年新西蘭長耳白兔通過隨機數字表法分成5組，每組6只，分別為：空白組、模型組、密蒙花顆粒劑組、安慰劑組、睪酮組。除空白組外，所有兔子的造模方式均為切除雙側睪丸及附睪[7]。

2.2 ?干預及療程

造模成功后，在第二天對各組兔子進行干預，具體的的干預方式為：空白組、模型組不灌胃;密蒙花顆粒劑組、安慰劑組從術后第3天開始進行灌胃，灌胃時間為30 d，按100 mg/kg灌胃，每日灌胃3次，密蒙花顆粒劑組灌胃藥物為密蒙花顆粒劑，安慰劑組為生理鹽水;睪酮組按0.5 mL/kg在兔大腿肌肉處注射丙酸睪酮注射液，每3天注射1次。療程均為30 d。

2.3 ?取材方法

灌胃結束后第1天取材。所有兔子采用空氣栓塞法處死，摘取雙眼淚腺組織，將標本置于4%多聚甲醛中固定24 h后，進行石蠟包埋及切片，備行免疫組化檢測。

2.4 ?免疫組化檢測

將所摘取淚腺組織進行免疫組化檢測，具體步驟為：石蠟切片經常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后切片，3% H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內源性過氧化酶，根據需要對組織切片進行預處理，滴加兔來源的一抗，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗，2 min×3次，滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，2 min×3次，選用DAB顯色，蒸餾水充分沖洗，選擇適當的封片劑進行封片。在高倍顯微鏡下觀察各組淚腺組織細胞結構，光鏡400倍視野下隨機選擇5個高倍視野，測定Caspase-1、IL-18的平均光密度值。

2.5 ?統計學處理

采用SPSS 23.0軟件對數據行統計學分析。實驗數據以“x±s”表示，進行正態性和方差齊性檢驗及單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 ?各組兔子淚腺組織細胞結構

免疫組化染色顯示空白組淚腺組織排列整齊，組織結構清晰;模型組淚腺組織排列不整齊，組織結構大片變性;密蒙花顆粒劑組淚腺組織排列整齊，組織結構清晰;安慰劑組淚腺組織排列不整齊，組織結構不清晰;睪酮組淚腺組織排列整齊，組織結構清晰。見圖1。

3.2 ?各組兔子淚腺組織中Caspase-1、IL-18的平均光密度值

與空白組相比，模型組Caspase-1、IL-18平均光密度差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組相比，安慰劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統計學意義（P>0.05）;密蒙花顆粒劑組和睪酮組Caspase-1、IL-18平均光密度值降低，差異有統計學意義（P<0.05）。與睪酮組相比，密蒙花顆粒劑組Caspase-1、IL-18平均光密度差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

4 討論

干眼的發病機制涉及許多細胞和分子過程[8-10]，包括炎性細胞因子增加、金屬蛋白酶高表達及淚液滲透壓改變等。Suzanne Hagan等[11]認為干眼是以慢性炎癥為特征的衰弱性病癥，盡管干眼最初的眼表損傷可能是多因素的（淚液量少、淚液質量差、使用隱形眼鏡等），但在大多數情況下，慢性疾病進展的惡性循環似乎相似——先天性免疫通路被激活，隨后觸發適應性免疫應答，如T細胞激活、一些細胞因子的釋放等，最終導致淚腺細胞損傷、淚液分泌不足，淚液分泌系統障礙又可降低淚膜的穩定性，形成惡性循環。淚腺功能喪失導致淚膜完整性被破壞，這是干眼主要的致病機制之一，淚膜功能障礙的主要原因在于淚液黏蛋白和脂質成分的改變，雄激素缺乏是淚液成分改變的促進因素[12]。

彭清華教授根據多年臨床經驗，結合干眼的發病機制，創制了密蒙花顆粒劑，密蒙花味甘，性微寒，入肝經，具有清熱瀉火養肝、明目退翳之功效，《本草經疏》中有：“密蒙花觀《本經》所主，無非肝虛有熱所致。蓋肝開竅于目，目得血而能視，肝血虛則為青盲膚翳，肝熱甚，則為赤腫、眵淚赤脈，及小兒痘瘡余毒，疳氣攻眼。此藥甘以補血，寒以除熱，肝血足而諸證無不愈矣?！爆F代研究發現密蒙花中的黃酮類物質具有擬雄激素的作用[13-14]，如蒙花苷、醉魚草苷、刺槐素等，發揮的擬雄激素作用可以抑制淚腺組織炎癥反應，降低淚腺細胞死亡率，提高基礎淚液分泌與淚膜破裂時間[15-16]，從而治療干眼，前期臨床研究證實其對干眼治療有效。

淚液的高滲透壓改變了眼表的物理環境，可引起角膜上皮細胞做出相應的改變，氧化的線粒體DNA激活Caspase-1，活化的Caspase-1將IL-18切割為活性形式，最終導致淚腺中IL-18大量表達[17]，這是干眼的一個重要病因[18]?；罨腃aspase-1還可增加間充質細胞和內皮細胞上IL-6及細胞黏附分子的水平，而IL-6在干眼中的作用已被實驗和臨床研究證實[19-20]。研究發現在干眼患者淚液中有Caspase-1高表達[21]，使用Caspase-1抑制劑可緩解干眼患者的癥狀[22]，證明Caspase-1在干眼的發生發展中起到重要作用。本實驗以新西蘭去勢雄兔為研究對象，在密蒙花顆粒劑組經過30 d灌胃后，去勢雄兔淚腺組織排列整齊，組織結構清晰，焦亡因子Caspase-1、IL-18的平均光密度值低于模型組，與睪酮組相比差異無統計學意義，表明密蒙花顆粒劑能抑制Caspase-1、IL-18表達，改善干眼癥狀，與雄激素的作用相當。

本研究發現密蒙花顆粒劑能抑制雄激素缺乏所致兔淚腺細胞焦亡因子Caspase-1、IL-18的表達，改善淚腺功能，這可能是密蒙花顆粒劑治療干眼有效的機制之一。

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