復方雞子黃油膏對大鼠創面修復中EGFR、FN、TGF-β1表達的影響

李艷華 唐智軍 夏鍇 余挽瀾 殷延陵 曹卉 王超 彭裕坤 蔣模威

〔摘要〕 目的 觀察復方雞子黃油膏對大鼠創面修復不同時期創面組織中表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、纖維結合蛋白（fibronectin，FN）含量及轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達的影響。方法 選取雌雄各半實驗大鼠40只，隨機分為空白組、模型組、龍珠軟膏組（龍珠組）、復方雞子黃油膏組（雞子黃組），除空白組外，每組予以小面積全層皮膚缺損創面造模，造模成功后各組予以相應干預，連續14 d，除空白組隨機取背部皮膚組織外，其他3組均分別于第7、14天取創面組織制作切片并同時進行免疫組化法測定EGFR、FN、TGF-β1。結果 治療后第7、14天雞子黃組EGFR、FN、TGF-β1含量均高于其他各組（P<0.05）。結論 復方雞子黃油膏通過提高創面EGFG、FN、TGF-β1的含量促進局部組織再生而起修復作用。

〔關鍵詞〕 復方雞子黃油膏;創面損傷修復;表皮生長因子受體;纖維結合蛋白;轉化生長因子β1

〔中圖分類號〕R285.5;R641 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.12.006

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of Compound Jizihuang Ointment on expression of epidermal growth factor receptor （EGFR）， fibronectin （FN） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in the granulation tissue at different stages of a rat model of excisional wound. Methods A total of 20 male and 20 female experimental rats were selected and randomly divided into a blank group， a model group， a Longzhu Ointment group （Longzhu group）， a Compound Jizihuang Ointment （Jizihuang group）. Except the blank group， each group was modeled with a small area full-thickness skin defect wound. After successful modeling， each group was intervened for 14 consecutive days accordingly. For the blank group， the back skin tissue was randomly taken. For the other 3 groups， wound tissue was taken for section at 7 days and 14 days and immunohistochemical method was used to determine EGFR， FN and TGF-β1. Results The expression of EGFR， FN and TGF-β1 of the Jizihuang group at 7 days and 14 days were significantly higher than other groups （P<0.05）. Conclusion Compound Jizihuang Ointment can repair the wound by increasing the content of epidermal growth factor receptor， fibronectin， and transforming growth factor β1 in the wound surface to promote local tissue regeneration.

〔Keywords〕 Compound Jizihuang Ointment; excisional wound healing; epidermal growth factor receptor; fibronectin; transforming growth factor-β1

創傷修復是指機體由于外傷或其他原因造成皮膚等組織出現離斷或缺損后，局部組織通過再生、重建進行修補恢復的一系列病理生理過程?，F代研究證明生長因子參與調控創傷修復的全過程[1]。我國傳統醫學對如何促進創面修復有著獨特的理解和豐富的臨床經驗，尤其是在創面的外治上充分發揮著中醫藥的優勢。因此，充分發揮外用中藥有效促進創面愈合的特長，探討生肌理論，具有重要的意義。復方雞子黃油膏是我院肛腸科傳統換藥制劑，經臨床應用，發現其能減輕創面疼痛、減少創面滲出、促進創面愈合[2]，但其具體作用機制尚不明確。本研究擬通過建立大鼠機械創傷模型，觀察復方雞子黃油膏對大鼠創面修復不同時期局部肉芽組織中表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor， EGFR）、纖維結合蛋白（fibronectin， FN）、轉化生長因子β1（transf？鄄orming growth factor-β1，TGF-β1）含量的影響，從分子水平探討復方雞子黃油膏促進創傷修復的部分機制，為該方劑今后的臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 ?實驗動物

健康SD大鼠，雌雄各半，質量為200～300 g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 ?藥品與試劑

復方雞子黃油膏（由本院制劑室提供，其處方由雞子黃、麻油、煅石膏、血竭等8味中藥組成，并按一定配比、特定方法熬制而成。規格：20 g/盒）;龍珠軟膏（武漢馬應龍股份有限公司規格：15 g/支，批號：170203）。ELISA試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 ?主要儀器

JJ-12J脫水機：武漢俊杰電子有限公司;JB-P5包埋機：武漢俊杰電子有限公司;D1008E掌上離心機：谷歌生物;RM2016病理切片機：上海徠卡儀器有限公司;凍臺：武漢俊杰電子有限公司。

1.4 ?造模及干預

1.4.1 ?動物造模[3]與分組 ?雌雄各半實驗大鼠40只，適應性飼養1周后，隨機分為4組：空白組（不造模，不予任何藥物干預）、模型組（僅造模，不予任何藥物干預）、龍珠軟膏組（龍珠組）、復方雞子黃油膏組（雞子黃組）。除空白組外，所有動物造模前1天，在大鼠的背部，用電剃刀備皮，剃毛面積約為7 cm×4 cm。次日，使用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后在脫毛處常規消毒，選擇背中部脊柱兩側各旁開1 cm，距肩胛骨以下2 cm處制備創面，用創傷制作器切割兩個直徑約為18 mm圓形創口，深及皮下深筋膜層，形成機械創傷動物模型。

1.4.2 ?干預 ?除空白組及模型組外，各組均勻涂相應藥膏0.5 mm厚于創面上，再以無菌紗布覆蓋，布膠帶“#”形固定，每日換藥1次，至造模成功后第14天。

1.5 ?樣本的制備

除空白組外，每組動物造模成功后第7天、第14天分別取左側、右側背部創面以愈合創面中心為圓點直徑18 mm的圓形組織，空白組隨機取相應部位同樣大小背部皮膚組織，同批4組標本每塊組織均勻分成2份，一份制作組織勻漿，另一份用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，切片厚5 μm。

1.6 ?指標檢測

1.6.1 ?皮膚組織形態學觀察 ?觀察各組創面治療后外觀，拍照時相機距離創面約8 cm。

1.6.2 ?酶聯免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法EGFR、FN、TGF-β1檢測 ?制作組織勻漿后的樣本，采用ELISA法檢測EGFR、FN、TGF-β1濃度，按試劑盒操作步驟進行。

1.6.3 ?免疫組化法EGFR、FN、TGF-β1檢測 ?福爾馬林固定，石蠟包埋切片后樣本進行免疫組化染色程序后封片，顯微鏡檢并圖像采集，圖像分析EGFR、FN、TGF-β1信號表達強度。免疫組化結果測定：陽性染色為棕色顆粒，定位于胞漿和/或胞膜。顯微鏡下進行組織學觀察。隨機選取10個高倍視野，觀察每個視野下的陽性細胞數，計算陽性表達率。

1.7 ?統計學處理

所有數據采用統計軟件SPSS 22.0進行統計分析，計量資料“x±s”表示，各組數據進行方差齊性檢驗，符合正態性及方差齊性時用單因素方差分析的方法，多組之間的比較采用Dunnett′s檢驗進行組間的兩兩比較，方差不齊時采用校正t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ?造模成功動物數量

實驗共使用SD大鼠40只，實驗過程中動物無死亡，實驗樣本全部納入結果分析。

2.2 ?皮膚組織形態學觀察

大體觀察見雞子黃組大鼠創面基本愈合，龍珠組大鼠創面縮小，模型組大鼠創面愈合緩慢。見圖1。

2.3 ?各組大鼠創面組織中不同時相點EGFR、FN、TGF-β1的表達情況

2.3.1 ?ELISA法分析 ?除空白組外，各組創面組織中EGFR、FN、TGF-β1表達均逐漸上升，組內比較，第14天均高于第7天（P<0.05）;模型組高于空白組（P<0.05）;龍珠組、雞子黃高于模型組（P<0.05），雞子黃組高于龍珠組（P<0.05）。見表1。

2.3.2 ?免疫組化法分析 ?免疫組織化學染色陽性區域表現為棕黃色或棕褐色沉淀，在第7、14天，各組創面組織中EGFR、FN、TGF-β1表達水平：雞子黃組>龍珠組>模型組>空白組。見圖2-4。

3 討論

由于致傷物機械力的作用而使人體產生的器官組織結構的破壞和（或）功能障礙稱為機械性損傷，機械性損傷最常見于皮膚，皮膚損傷后，創面愈合慢，可能導致感染，甚至癌變，因此，加速創面愈合不僅可以減少感染機會，而且可以減少患者痛苦。

EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，在細胞生理過程中發揮重要的調節作用。目前有實驗研究表明皮膚愈合過程中表皮生長因子（epidermalgrowthfactor， EGF）對上皮細胞生長起主導作用，對創面愈合中后期的再上皮化有著特殊效果，同時還可促進成纖維細胞的非膠原性蛋白合成，選擇性抑制Ⅰ型膠原產生，促進傷口愈合[4-7]。

FN具有特別的分子結構，對膠原、肌動蛋白、纖維和其它分子有很高的親合能力，它不僅可以協助網狀內皮系統清除異物，而且可以在創口愈合中與膠原和纖維連接而決定傷口的關閉和（或）愈合[8]。FN具有粘性吸附的作用，可以包裹部分細菌及組織碎片并由巨噬細胞消化，加速機體清除傷口內異物，還可以作為移行細胞接觸的臨時基質，另外，FN先于膠原物質沉積于傷口并使傷口收縮，成為明膠基質的骨架，加速傷口愈合。

TGF-β1作為轉化生長因子中的一員，在創面修復中起重要作用。它作為成纖維細胞最強的趨化因子，在促進成纖維細胞增殖、遷徙、分化中起重要作用，TGF-β1趨化成纖維細胞向基底遷徙增殖，促進成纖維細胞分泌膠原蛋白及纖維連接蛋白形成臨時的細胞外基質（extracellularmatrix， ECM），從而促進肉芽組織形成[9]。TGF-β1趨化上皮細胞分裂增殖，增加角化細胞的運動性，利于完整上皮覆蓋及膠質沉積[10]。同時，可促進血管內皮生長因子、血小板源性生長因子等作用的發揮，從而間接促進新生血管形成[11]。

研究結果顯示，經龍珠軟膏及復方雞子黃油膏涂搽治療14 d的機械創傷大鼠其創面近愈合，而模型組創面愈合差，與模型組及空白組比較，龍珠軟膏組及復方雞子黃油膏組創面組織中EGFR、FN、TGF-β1表達均增加，而復方雞子黃油膏組增加更為明顯。

復方雞子黃油膏是湖南中醫藥大學附屬常德醫院肛腸科傳統換藥制劑，通過本次實驗結果可以證實，復方雞子黃油膏可以提高創面EGFR含量，從而增加其與EGF的結合，促進非膠原性蛋白合成。復方雞子黃油膏同時提高FN和TGF-β1的表達，利用FN的粘附特性構建基質骨架，促進成纖維細胞增殖分化，形成肉芽組織，促進傷口愈合。但是，EGFR、FN、TGF-β1只是眾多復雜信號通路中的一部分，且本研究在大鼠創面愈合的整個過程中僅選擇了2個時相點進行標本采集和檢測，不能完全闡述完整的創面愈合過程，且未行HE染色，因此，有關復方雞子黃油膏促愈的具體作用機制，仍需從完整的信號通路及病理等方面進一步研究探討。

參考文獻

[1] YOUNG A， MCNAUGHT C E. The physiology of wound healing[J]. Surgery （Oxford），2011，29（10）：475-479.

[2] 唐智軍，劉 ?淳，孔祥建，等.復方蛋黃油膏對低位單純性肛瘺術后創面愈合影響的臨床研究[J].湖南中醫藥大學學報，2011，31（10）：12-14，23.

[3] 趙京禹，付小兵，雷永紅.大鼠小面積全層皮膚缺損創面模型的制備[J].創傷、炎癥、修復，2008，9（1）：64.

[4] 羅肇林，梁自乾.表皮生長因子受體在糖尿病性創面修復中的研究進展[J].醫學綜述，2008，14（5）：721-723.

[5] BEMIER J， BONNER J， VERMORKEN J B， et al. Consensus guidelines for the management of radiation dermatitis and coexisting acne-like rash in patients receiving radiotherapy plus EGFR inhibitors for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Annals of Oncology， 2008，19（1）：142-149.

[6] WOLLENBERG A， KROTH J， HAUSCHILD A. Cutaneous side effects of EGFR inhibitors-appearance and management.[J]. Deutsche Medizinische Wochenschrift， 2010，135（4）：149-154.

[7] THULA T T， SCHULTZ G， TRAN-SON-TAY R， et al. Effects of EGF and bFGF on Irradiated Parotid Glands[J]. Annals of Biomedical Engineering， 2005，33（5）：685-695.

[8] 肖 ?赫，李雅嘉，王 ?華，等.纖維連接蛋白在糖尿病足潰瘍中的研究進展[J].中國老年學雜志，2017，11（37）：5474-5475.

[9] DEMIDOVA-RICE T N， HAMBLIN M R， HERMAN I M. Acute and Impaired Wound Healing[J]. Advances in Skin & Wound Care， 2012， 25（7）：304-314.

[10] 王少霞，任俊輝，楊蕾蕾，等.皮膚創傷修復過程中TGF-β1及膠原表達變化的定量研究[J].中國體視學與圖像分析，2015，20（1）：58-67.

[11] 武 ?姍.轉化生長因子β及其受體在糖尿病足創面愈合過程中作用機制的研究進展[J].中國糖尿病雜志，2017，25（6）：569-572.